高效液相色谱法测定龙血竭丸中龙血素B的含量

　　【摘要】 　　目的 用高效液相色谱（HPLC）法测定龙血竭丸中龙血素B的含量，建立含量测定方法。方法冰醋酸溶液（1→90）-乙腈（61∶39）为流动相 ,流速为1 ml/min，柱温为室温，检测波长260 nm。结果龙血素B浓度在14～84 μg/ml范围内呈良好的线性关系，r=0.999 9，n=6，龙血素 B的加样回收率99.88% ，RSD=0.314%。结论该方法简便，准确，可靠，便于生产时制剂的质量控制。

　　【关键词】  龙血竭丸；龙血素B；高效液相色谱法

　　Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of Loureirin B in Dragon blood pills. MethodsThe mobile phase was composed of glacial acetic acid solution(1→90) -acetonitrile(61∶39)  and the flow rate was1ml/min. The detection wavelength was 260 nm.ResultsThe standard curve of Loureirin B was linear in the concentration range of 14～84μg/ml, r=0. 9999. The average recovery was 99.88%,RSD was 0.314%. ConclusionThe method is simple and reliable for determination of Loureirin B. The content of Loureirin B in dragon blood pills of different brands all matches the national standard.

　　Key words:Dragon blood pills;   Loureirin B;   HPLC

　　龙血竭丸为广西中医学院制药厂研制的新制剂，由国产龙血竭加工而成。龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化淤、消肿止痛、收敛止血、软坚散结、生肌敛疮等功效［1］。现代医学研究证实，龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。其质量标准中缺少含量测定方法。本文采用高效液相色谱法建立含量测定方法。现将结果报道如下。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器

　　LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-10A紫外检测器（VWD），LC-10AD泵，威犸龙液相色谱工作站，AG135电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），JA5003N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司），SB-2200T超声清洗仪（上海必能信公司）。所用仪器和量具均经校正和检定。

　　1.2  材料

　　龙血素B对照品（中国药品生物制品鉴定所,批号111558-200303），龙血竭丸（广西中医学院制药厂药品研究所提供），乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其它试剂为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

　　色谱柱为Kromasil 100-5 C18（5 μm,4.6 mm × 250 mm）；流动相为冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）；检测波长为260 nm，柱温为室温，流速为1.0 ml/min;进样量10 μl［2］。

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备

　　精密称取龙血素B对照品1.52 mg，置于25 ml容量瓶中，加冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）溶解，并稀释至刻度，摇匀，得浓度为60.8 μg/ml的对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备

　　取龙血竭丸20 粒，研成细粉，取0.25 g，精密称定，置于25容量瓶中，加冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）22 ml，超声处理15 min，放冷，加冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，作为供试品溶液。

　　2.3  标准曲线

　　精密称取龙血素B对照品3.50 mg，置于25ml容量瓶中，加冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）溶解，并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取1，2，3，4，5，6 ml到10 ml容量瓶，加冰醋酸溶液（1→90）乙腈（61∶39）配成浓度为：14.0，28.0，42.0，56.0，70.0，84.0 μg/ml的标准液，按上述色谱条件分别进样10 μl，测定峰面积。以龙血素B的浓度（μg/ml）为横坐标 ,峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=24 515.622X+145.667，R=0.999 9。龙血素B浓度在14～84 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

　　2.4  精密度实验

　　取对照品溶液在上述色谱条件下重复进样5 次，10 μl/次, 测定峰面积, 结果RSD为1.15%（n=5）。

　　2.5  稳定性实验

　　取同一样品溶液分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定峰面积,结果RSD为1.36%（n=6）,表明样品在24 h内稳定。

　　2.6  重复性实验

　　取同一批号的龙血竭丸6 份，按正文含量测定方法平行实验,测定其平均含量为4.79 mg/g，RSD为1.81%。

　　2.7  加样回收率实验

　　精密称取已知含量的同一批样品(含量为4.79 mg/g)约0.125 g,分别精密加入龙血素B对照品适量,按正文供试品溶液的制备方法制备供试液,平行试验6份,按正文色谱条件,测定其含量,计算回收率。结果见表1 。表1  回收率测定结果（略）

　　2.8  样品含量测定

　　按前述色谱条件，分别对5批样品进行测定。结果（两次平均值）分别为：4.68，4.45，4.79，4.62，4.73 mg/g。

　　3  讨论

　　龙血素B(4-羟基-2,4,6-三甲氧基二氢查耳酮)是龙血竭中的主要有效成分,现有的文献报道中大多测定的是药材中龙血素B的含量［3］，而制剂相关的文献较少。用 HPLC法测定龙血素B的含量，方法稳定，结果准确，可作为本制剂的质量控制方法。

　　3.1  流动相选择根据报道，比较了乙腈-水系统［4］、甲醇-1%冰醋酸系统、甲醇-0.1%磷酸系统、乙腈-0.1%磷酸系统，效果均不如乙腈-冰醋酸溶液（1→90）系统理想。

　　3.2  色谱柱选择在实验中，比较了Hanbon Lichrosphen C18（5 μm,4.6 mm × 250 mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm,4.6 mm×250 mm）和Kromasil 100-5 C18（5 μm,4.6 mm×250 mm），分离度均大于1.40，理论塔板数均大于16 000，满足实验要求，但Kromasil 100-5 C18 柱分离效果最好，故本实验采用Kromasil 100-5 C18 柱。

　　【参考文献】

　　［1］文东旭.龙血竭的研究进展［J］.中草药,2001,32(11)：1053.

　　［2］黄捷,高辉,谢培德,等. 反相高效液相色谱法测定广西血竭中龙血素B的含量［J］.药物分析杂志，1996，16(4)：234.

　　［3］孙胜利,宓鹤鸣,娄子洋.反相高效液相色谱法测定国产血竭中龙血素A和B的含量［J］.第二军医大学学报，2002，23(12)：1366.

　　［4］文东旭,刘伟林,陈 骞,等.反相高效液相色谱法测定龙血竭中剑叶龙血素 C的含量［J］.广西科学，2003,10(4)：279.