变性高效液相色谱法筛选XRCC4基因突变

【摘要】  　　目的 应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)异源双链分析对鼻咽癌患者XRCC4基因突变进行筛查与鉴定，研究鼻咽癌患者XRCC4的基因突变情况，探讨DHPLC在筛查相关基因突变、预测放疗敏感性方面的应用。 方法 采用聚合酶链反应(PCR)和DHPLC筛查88例鼻咽癌患者XRCC4基因的突变。 结果 对DHPLC图形异常的PCR扩增片断进行DNA测序鉴定突变位点及性质，检测出28例XRCC4基因8号外显子第377位C变成T，导致126号密码子的ser→phe，导致氨基酸残基的替代变化(丝氨酸→苯丙氨酸)。 结论 用PCRDHPLC筛查结合测序分析检测XRCC4突变是一种高效、经济、简便、可靠的方法。

【关键词】  鼻咽肿瘤 辐射耐受性 突变 肿瘤细胞 培养的 DNA修复 色谱法 高压液相 基因型

　　DNA分子是恶性肿瘤放疗辐射作用的靶点，细胞对电离辐射反应的分子基础是DNA损伤[1]。DNA双链断裂是放射治疗过程中的主要损伤形式，而细胞内产生的DSBs可以通过同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复。未修复的DSBs损伤将导致细胞死亡。近年来的研究表明，DNA修复基因突变、单核苷酸多态性均可改变DNA的修复能力。因此检测DNA修复基因的分子状态可能成为个体肿瘤放疗敏感性的预测指标。XRCC4是DNA损伤修复的主要基因之一，缺乏XRCC4的细胞特别容易受到离子辐射的伤害。XRCC4基因的突变可能影响肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，进而影响其对辐射的敏感性以及放射治疗的疗效。因此，XRCC4基因的突变检测可为其与肿瘤放射敏感性关系的研究以及探讨作为肿瘤个体放疗敏感性的预测指标的可行性提供研究基础。

　　变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC)是一种高通量筛选基因组DNA序列变异的新手段。本研究采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DHPLC异源双链分析与DNA测序等方法对88例鼻咽癌患者进行XRCC4基因突变筛查与鉴定，探讨DHPLC检测该基因突变的适宜条件，为DHPLC技术在筛查相关基因突变，预测放疗敏感性的应用方面提供研究基础。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 收集2002年9月-2003年9月福建省肿瘤医院放疗科经病理确诊、初治的鼻咽癌患者88例，男性67例，年龄(48±12.71)岁(21～76岁);女性21例，年龄(48±11.15)岁(26～69岁)。治疗前经鼻咽镜取鼻咽活检组织。DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司);Taq DNA聚合酶(金牌酶，瑞士Roche公司);基因扩增仪(PTC200，美国BIORAD DNA ENGINE公司);DHPLC(4500WAVE，美国Transgenomic公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA抽提 用组织DNA抽提试剂盒抽提患者鼻咽部癌组织基因组DNA，核酸蛋白检测仪定量，-20 ℃保存备用。

　　1.2.2 PCR引物设计与合成 人类XRCC4基因有8个外显子，因为此基因突变多发生于其1号、4号、7号和8号外显子，其中第8外显子较长，需分成2个相互重叠的片段进行扩增，故选择这4个外显子设计5对引物。引物由上海博鸿生物公司合成。引物序列如下：片段名引物名引 物 序 列Exon1R

　　FCCGGAAAAGGCGGGATTTAG

　　GGGGATTCTCGCATTGTGGAExon4R

　　FGTGTATGCTTAAAACCAGGC

　　AACAACATAAAGAGGGCTCCExon7R

　　FTCAATGCTAAAACAGCAAGT

　　GATTCAAACATTTTACAATTCCExon81R

　　FCTTTTACTCTATAACAGAAGTT

　　ATAGTTTAGAATAATGTGCCExon82R

　　FGTGAATTGAAACCATTGTGC

　　GGTTACATTTACATTAATAAGCAGT

　　1.2.3 PCR反应体系及条件 PCR反应体系50 μL，含0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+，DNA模板100 ng，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各0.2 μmol/L。PCR反应条件：94 ℃变性10 min→94 ℃ 40 s→54 ℃～64 ℃ 45 s→ 72 ℃ 35 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，PCR产物用1%琼脂糖(含溴化乙锭0.5 μg/mL)凝胶电泳检测。

　　1.2.4 DHPLC筛选XRCC4突变 对有效扩增的PCR 产物行DHPLC筛查突变，检测PCR反应产物，其分离柱固相为烷基化C18，中间桥分子为TEAA，洗脱缓冲液主要成分为乙腈。标本上机之前通过软件分析序列的理论温度分离曲线，摸索出最佳的分离温度后进行突变筛选分析。

　　1.2.5 DNA测序 根据DHPLC系统检测结果，将不同峰型的PCR产物送日本TAKARA公司进行DNA序列测定。

　　2 结 果

　　2.1 DHPLC筛查结果 每份样本均检测上述5个片段的PCR产物，每份样品在50 ℃的非变性温度下均为对称性单峰;在部分变性的温度下，1号、4号、7号和8号外显子的81片断均为单个色谱峰，只有8号外显子的82片断的扩增产物出现杂合峰与纯合峰两种情况，单个色谱峰显示为纯合链，双峰或三峰表示是杂合异源双链。出现杂合峰显示有突变的异源双链存在。不同样品的PCR产物的8号外显子82段在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同(代表峰形见图1)，提示8号外显子的82段具有单一类型的突变。

　　2.2 DNA测序结果 选择DHPLC检测为杂合峰与单个峰的标本测序，测序结果显示28例患者的XRCC4基因第8号外显子第377位碱基C变成T(图2)。

　　3 讨 论

　　DHPLC异源双链分析法是近年来才发展起来的一项新的基因突变高通量筛查技术。与其他相关技术相比，DHPLC的DNA分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命(>6 000次进样)和极好的分析稳定性(99%)。DHPLC异源双链分析法解决了RFLP技术受酶切位点和酶切条件的限制、扩大了检测范围、提高了检测的准确性、又解决了SSCP技术耗时耗力的缺点，实现了样品的自动化检测;同时检测的灵敏度、重复性和检测的通量也得到大提高，从而在基因筛查工作中具有更广泛的应用范围[2]。已有学者进行了DHPLC相关的方法学比较研究，均提示其敏感性和特异性可达96%～100%[3]，明显高于常用的变性梯度凝胶电泳、构象敏感性凝胶电泳、单链构象多态性分析等变异检测技术。DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性[45]。

　　本组资料应用DHPLC分析鼻咽癌组织XRCC4的突变，探讨DHPLC检测该基因突变的适宜条件。由于PCR产物中杂带的存在会导致目的峰周围出现干扰峰，这些干扰峰往往会误判为突变峰形，应用DHPLC分析时笔者通过以下几种方法来排除干扰峰：(1)通过优化PCR反应条件防止杂带产生;(2)通过比较部分变性温度和非变性温度下的峰形来排除干扰峰，凡是在部分变性温度下呈现的双峰或多峰在50 ℃的非变性温度下同样表现出来，则提示有干扰峰的存在;(3)通过保留时间来判断有无干扰峰存在，因为突变引起的双峰或多峰的保留时间应相差不大。

　　本研究通过PCRDHPLC筛查，共检测了88例患者XRCC4基因各5个片段的PCR产物，在部分变性的温度下，28例患者的8号外显子82所扩增的片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况，经DNA测序分析证实单个色谱峰样本未测出突变，双峰或三峰样本检测出突变，即8号外显子第377位碱基C变成T，此外，不同样品的PCR产物的8号外显子在同一DHPLC运行条件下突变峰形基本相同，提示8号外显子具有单一类型的突变。该变异导致126号密码子的ser→phe，致使氨基酸残基发生替代变化(丝氨酸→苯丙氨酸)，这一替代对改变DNA修复能力的作用以及是否影响鼻咽癌细胞DNA损伤修复能力和放射治疗疗效，还有待于进一步的研究探讨。

【参考文献】
  　　[1] Shrivastav M, De Haro L P. Regulation of DNA doublestrand break repair pathway choice[J]. Cell Res, 2008,18(1):134147.

　　[2] Yeh H M, Tsai M C,Su Y N,et al. Denaturing high performance liquid chromatography screening of ryanodine receptor type 1 gene in patients with malignant hyperthermia in Taiwan and identification of a novel mutation (Y522C)[J]. Anesth Analg, 2005,101(5):14011406.

　　[3] Fackenthal D L, Chen P X, Das S. Denaturing highperformance liquid chromatography for mutation detection and genotyping[J]. Methods Mol Biol, 2005,3110(5):7396.

　　[4] Tseng C P,Huang C L,Chong K Y,et al. Rapid detection of glucose6phosphate dehydrogenase gene mutations by denaturing highperformance liquid chromatography [J]. Clin Biochem, 2005,38(11):973980.

　　[5] Panayiotou K,Kaprara A ,Sarika L,et al. Efficient testing of the RET gene by DHPLC analysis for MEN 2 syndrome in a cohort of patients[J]. Anticancer Res，2005,25(3B):20912095.