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王九成1，2 惠民权1，2 焦亚奇1，2 胡忍乐2 袁民正2， 傅经国1，3 陈涛1，4*
1陕西省脂质体工程技术研究中心； 2西安力邦医药科技有限责任公司； 3河南省科学院化学所；
4西安力邦制药有限公司 陕西西安 710075
〔中图分类号〕R979.1 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1671-3141（2003）04-0746-04
[摘要]本实验研究了以卵磷脂和卵磷脂/胆固醇为包材，采用薄膜分散-挤压法制备阿霉素纳米脂质体的工艺过程及包封方法。采用三瓶装的保存方式，在临床使用前，利用pH梯度载药法制备注射液，较好地解决了脂质体药物的存放难题。稳定性研究证明本方法制备的脂质体各种质量指标都与国外同类产品一致。
0 前言
大量的文献资料证明抗肿瘤和抗感染药物被包裹在脂质体中可以在某种程度上提高药物靶向性，并大幅度地降低药物的毒副作用，从而提高治疗指数[1-3]。脂质体包裹的阿霉素可明显地降低心脏毒性和皮肤毒性，试验动物的存活率比游离药物对照组高[4-6]。二十多年来，多种脂质体阿霉素制剂配方见诸于文献，具有代表性的有以卵磷脂/胆固醇制备的常规脂质体[7]，含有棕榈酸葡萄糖酯/二棕榈酸卵磷脂/胆固醇的脂质体，氢化卵磷脂为包材的稳定脂质体[8]，和聚乙二醇修饰的长循环脂质体[3]。 其中聚乙二醇修饰的长循环脂质体阿霉素（商品名Doxil）已经被美国食品和药品管理局(FDA)于1995年批准在欧美和日本上市用于治疗与艾滋病相关的Kaposi肉瘤，常规脂质体阿霉素（商品名Myocet）也于2002年在欧洲被批准作为一线用药上市销售。脂质体药物目前在国内虽然有厂家或研究机构在研制，但由于包材、设备及技术方面的限制，都没有较好地解决包埋率和稳定性问题，因而还没有SFDA批准的产品上市。本科研组采用了国际上先进的脂质体制备技术和分析方法，成功开发出包封率高、稳定性好的三瓶装脂质体阿霉素注射液。该制剂由空白脂质体、阿霉素及碱性缓冲溶液三瓶组成，临用前采用pH梯度法将阿霉素装载入脂质体中配制成阿霉素脂质体注射液。配制的步骤是先将酸性缓冲溶液中制备而成的空白脂质体与碱性缓冲溶液混合，再盐酸阿霉素混溶，从而形成脂质体双层膜内外的pH梯度。这种三瓶装产品形式很好地解决了药品长期保存产生的药物渗漏和稳定性问题，保证了高包封率和临床疗效。使用的辅料为蛋黄卵磷脂和胆固醇，价格较低廉，便于推广使用。本文将重点讨论小规模实验室水平的空白脂质体制备、pH梯度阿霉素包埋法、脂质体和脂质体阿霉素的稳定性及相关的质量控制。
1 仪器与试剂
1.1 试验设备和仪器
Lipex®挤压器（加拿大北方脂质体公司制造）；聚碳酸盐滤膜（Nuclepore®100nm,80nm滤膜，美国沃特曼公司，Whatman制造）；激光散射粒径仪（ Nicomp 370 submicron particle sizer，Santa Burbara, CA，制造）；P2000液相色谱仪（美国Thermo Seperation）；蒸发光散射检测器（ELSD）（Sedex 55 法国 Dikma）；N2000色谱数据工作站（浙江大学）；色谱柱，YMC PVA Silicon Gel，4.6×250mm（Waters Company），5um。电子恒温水浴锅 H.H.S 21-4（上海医疗器械五厂）；数显干燥箱101A-1型（北京化玻联医疗器械有限公司）；数显电冰箱BCD-251e（伊莱克斯）；卡氏水分测定仪701KF（Titrino 瑞士万通）；精密pH计PHS-3C（上海雷磁）；台式离心机LD5-2A （北京医用离心机厂）；照度计JD-1A（上海嘉定学联仪表厂）
1.2 药品和试剂
脂质体包材为高纯度蛋黄卵磷脂（含量＞98%）和高纯度胆固醇（含量＞98%）。高纯度蛋黄卵磷脂和胆固醇分别由蛋黄卵磷脂粗品（卵磷脂含量25%，购自陕西嘉德生物工程有限公司）和95%胆固醇（购自陕西省嘉德生物技术有限公司）精制提纯而得（卵磷脂和胆固醇的提纯研究另文讨论）。注射用盐酸阿霉素，规格50mg/瓶，由汕头经济特区明治医药有限公司生产并免费提供；一水柠檬酸购自石河子市长运生化有限责任公司；二水柠檬酸三钠购自湖南银海石油化工有限公司；无水乙醇购自西安制药厂；无水碳酸钠由西安力邦制药有限公司提供；色谱纯氯仿，异丙醇和甲醇购自美国Tedia公司；卵磷脂对照品（纯度99.8%）由德国Lipoid公司惠赠；所有其它化学试剂都为商业所能得到的最高纯度，这些试剂未经进一步提纯而直接用于本实验。
2 实验方法
2.1 脂质体制备 依照Hope 等发表的挤压法制备大单室脂质体[9]。取适量的磷脂混合物（卵磷脂/胆固醇，55：45 摩尔比）共溶于氯仿/甲醇，加入圆底烧瓶，旋转蒸发除掉有机溶剂形成均匀的混合磷脂薄膜，真空干燥过夜。在含有磷脂膜的圆底烧瓶内加入300mM柠檬酸钠缓冲溶液，快速振荡使磷脂膜水合而溶解，可以间隔地将容器置于55°C水浴中加快磷脂膜水合过程，整个步骤大约在1h左右。将得到的多层脂质体（multilamellar vesicles， MLVs）在55°C用挤压器(Lipex Biomembranes, Inc., Vancouver, BC, Canada)反复多次挤压通过双层100 nm孔径的薄膜(Nucleopore)，即得到所需的大单室脂质体。用注射用水调节脂质体浓度至100mg/mL总磷脂并用0.22um的滤膜过滤除菌，分装。
2.2 pH梯度法配制阿霉素脂质体注射液 吸取20mL 0.9%氯化钠注射液（不包括在本品三瓶包装中）加入到注射用盐酸阿霉素瓶（瓶1）中振摇使盐酸阿霉素完全溶解。将溶解好的盐酸阿霉素放在水浴锅（55-60℃）中加热10min。吸取1.9mL脂质体注射液（瓶2）加入到碳酸钠溶液（瓶3）中，摇匀。用注射器吸取瓶3中配制的所有脂质体溶液，加入加热好的盐酸阿霉素溶液并剧烈振摇2min。混合溶液在55～60℃平衡10min后在室温条件下储存。配制好的盐酸阿霉素脂质体注射液约有25mL，浓度约为2mg/mL。临床使用的脂质体阿霉素脂质体注射液用0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液稀释至40～120mL，其中含盐酸阿霉素50mg，最终浓度为0.4～1.2mg/mL。
2.3 质量考察
2.3.1 卵磷脂定量分析 色谱柱：YMC PVA Silicon Gel，4.6×250mm（Waters Company），5um；流动相A：氯仿-异丙醇（50:50）；流动相B：氯仿-异丙醇-水（36:55:9）；采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～3.0min使用流动相A洗脱，3.0～11.5min使用流动相B洗脱，11.5～30.0min使用流动相A洗脱。流速：1.0mL/min；检测器漂移管温度：40℃；柱温：室温；进样量：20uL；理论塔数按磷脂峰计算应大于4000。
2.3.2 脂质体粒经测定 脂质体样品适量，生理盐水稀释后，用激光散射粒径仪（Nicomp 370 submicron particle sizer）测定脂质体粒经及分布。
2.3.3 脂质体形态观察 0.1～0.3uL脂质体样品溶液置于双层铜片之间，用特制装置将夹有脂质体样品的铜片快速浸入液态丙烷冷冻，切片并以电子显微镜观察、拍照。
2.3.4 药物包封率的测定 精密量取配置好的阿霉素脂质体样品，加入有0.2um的离心管，低温超速离心30min（RCF: ）,取滤液测定吸光度，计算游离阿霉素的浓度，所给公式计算包封率
包封率 = （1 – C游离/C总量） × 100%
2.4 稳定性试验
2.4.1 空白脂质体的稳定性 模拟上市包装，在不同条件下考察了脂质体的稳定性。其中包括在光照、4℃冷藏、室温留样、40℃、60℃、80℃高温及30℃加速试验条件下，产品外观、pH值、卵磷脂含量、卵磷脂有关物质、胆固醇含量、胆固醇有关物质、粒径及包封率等指标的变化。由于本实验所用包材含量及有关物质都无紫外-可见光吸收，所以笔者采用HPLC与ELSD联用。破坏实验产生的降解产物和有关物质峰都能分开，卵磷脂的HPLC图谱见图1。HPLC分析方法另文讨论。
图1、卵磷脂的HPLC分析图谱
2.4.2 阿霉素脂质体注射液的稳定性 按照前述阿霉素脂质体注射液的配制步骤配制成临床用阿霉素脂质体注射液，分别考察了4℃冷藏、室温放置、30℃加速等条件下对包封药物后阿霉素脂质体溶液的性状、pH值、粒径、包封率和24h突释效应的影响。
3 结果
3.1 空白脂质体的制备及主要影响因素
本实验联合应用薄膜分散法和挤压器成功的制备了大单室脂质体、脂质体的粒径及形态.见图2和3。脂质体的粒径受聚碳酸盐滤膜孔、滤膜层数及挤压次数的影响。从图4可见使用两层100nm孔径滤膜经过4次挤压，脂质体粒径即可降到120nm 左右并趋于恒定，用一层100nm孔径滤膜，挤压的次数需要增加。脂质体粒径与滤膜孔径成正比关系，当使用80nm孔径滤膜,得到的脂质体粒径可达到100nm。挤压器整合和缩小脂质体粒径是通过高压将多室脂质体挤压通过一定的聚碳酸盐滤膜孔径，本实验所用的磷脂脂质体配方是卵磷脂和胆固醇，具有很大的柔软性和可塑性，容易变形通过滤膜，所以实际得到的脂质体粒径较滤膜孔径大20nm左右。对于刚性包材比如氢化卵磷脂和胆固醇制备的脂质体，此法得到的脂质体的粒径与滤膜孔径会非常接近（结果不在此讨论）。综合相关因素，优化后的最终生产工艺采用串连的两个挤压器，每个挤压器用五张100nm的聚碳酸盐滤膜，一次挤压成型。最终产品的相关质量数据：包材为蛋黄卵磷脂和胆固醇以55：45摩尔比，300mmol/L的柠檬酸缓冲液（pH 3.97）,1.9 mL/瓶，100mg脂质/mL，粒径120nm的脂质体溶液。
图2、脂质体粒径（激光粒径图谱）
图3、脂质体外观形态（冷冻切片电子显微照片）
图4、挤压次数对脂质体粒径的影响曲线
3.2 阿霉素脂质体注射液的配制
设计的最终产品形式为一盒三瓶装，临床使用前简单地将三个药瓶的内容物混合配制而成（如图5）。三瓶的处方如下：
瓶1，注射用盐酸阿霉素：50mg/瓶，汕头经济特区明治医药有限公司生产。批准文号：粤卫药准字（1999）第313002号；
瓶2，空白脂质体：1.9 mL/瓶，100mg脂质/mL，120nm粒径脂质体溶液，由蛋黄卵磷脂和胆固醇以55：45摩尔比以300mM的柠檬酸缓冲液（pH 4）为水相制备而成；
瓶3，碳酸钠注射液：3.0 mL/瓶，0.5M， pH 11.4。
图5、脂质体阿霉素注射液配制示意图
本实验应用pH梯度法将阿霉素载入脂质体，其工作原理见示意图6。阿霉素穿过脂质体双层膜进入脂质体内的平衡示意图[10]。脂质体内外较大的质子浓度差，促使阿霉素聚集于脂质体内。进入脂质体内阿霉素与柠檬酸盐离子形成复合物，从而使更多的阿霉素进入脂质体内。阿霉素进入脂质体内的速度主要取决于脂质体膜的相变温度，所以，阿霉素包入脂质体的速度随水浴的温度升高而加快。如图7，20oC 53%阿霉素包入脂质体，需要60min；40oC 98%阿霉素包入脂质体，需要50min；而60oC仅仅只要5min即可得到98%以上的高包封率。为了保证获得98%以上的包封率，最终的配制方法为在60oC水浴中恒温静置10min。装药后脂质体的粒径没有明显变化。阿霉素脂质体在室温放置，4d没有药物渗漏，各项质量指标都符合要求，也没有发现体外突释效应的变化。
图6、pH梯度法载药的原理示意图
图7、阿霉素随温度进入脂质体内的速度曲线
3.3 影响因素试验
影响因素试验结果证明，光照对脂质体的质量无明显影响。脂质体冷冻（温度<-15℃）保存10d，取样检测除粒径有较大增长外，其他指标均无明显变化，提示本品在冷冻下具有粒子凝聚作用。室温放置6个月，各项指标均无明显变化，产品在室温具有一定的稳定性。加速试验结果表明，高温对脂质体的影响非常大。图8总结了不同温度条件下脂质体粒径的变化趋势，在考察的10d里，4oC和25oC时脂质体粒径无变化；40oC时粒径在10d后有微小的增大；60oC时10d时粒径变为170nm；而80oC粒径增大到300nm。与高温时粒径的增大相对应EPC和胆固醇含量明显下降，有关物质上升趋势较快，包封率下降（见表1），而且装药后脂质体体外突释效应有所增大，表明高温条件磷脂和胆固醇降解较快，脂质体不能在高温保存。
表1、主要质量指标在指定条件下进行加速实验中十d后的变化
质量考核项目
4oC
25 oC
40 oC
80 oC
EPC 含量(%)
100
100
98.4
91.8
胆固醇含量(%)
100
100
99.2
89.1
脂质体粒径(nm)
121
120
132
306
包封率(%)
99.2
98.9
98.4
90.8
相关物质含量(%)
1.0
1.02
1.55
16.3
pH 值
3.98
3.98
3.97
3.92
外观
无变化
无变化
无变化
无变化
EPC 和胆固醇含量是以原始含量为基准计算，相关物质含量是EPC和胆固醇的相关物质的总和。
图8、加速试验中脂质体粒径变化曲线
4 讨论
脂质体是很好的药物载体，其无毒、高载药量、靶向性、无免疫原性和可修饰性都已经得到了证实。但是，由于脂质体的质量在很大程度上受包材、制备方法及载药方法的影响，要使最终产品达到安全、有效及可控，难度较大。
大豆磷脂中的不饱和键含量高，易于氧化变质。虽然用在口服制剂中可以扑灭自由基，有一定的保健作用。但是其易于氧化水解，稳定性差，不宜用作脂质体药物制剂的包材。国外文献指出,在卵磷脂和胆固醇配方中,当两种包材的摩尔比率为55:45时，毒性最小。对于阿霉素脂质体制剂来说，血液中的脂质蛋白容易与缺乏胆固醇的脂质体作用，使阿霉素容易泄漏引起毒性增加。在脂质体制剂中选用高纯度的包材是保证药物质量的关键，本实验的稳定性研究证明，虽然磷脂或胆固醇仅仅降解了10%，但包封率、粒径及酸值等许多指标却发生了很大变化。所以用于脂肪乳的80%纯度的卵磷脂不能用于制备静脉注射用脂质体药物制剂。对于脂质体药物，除了需要保证主药的稳定性以外，包材的稳定性也需严格控制。包材和制成的脂质体都应于低温保存，以防止包材降解对脂质体质量的影响。
pH梯度法是当今发明的最有效的脂质体药物包埋方法，但是脂质体内的酸性条件，对许多药物的稳定性影响很大。三瓶装制剂产品，将药品、脂质体和缓冲液分而置之，在使用前再将药物载入脂质体中，可以很好地避免这一缺陷。
本实验结果表明我们选用的脂质体包材和生产工艺制备的脂质体无论包材含量、相关物质、粒径、包封率及其他指标都能达到临床用药的质量要求。三瓶装和低温保存也能较好的解决药品的稳定性和脂质体药物在存放时的早期药物泄露。动物体外实验证明我们生产的阿霉素脂质体与游离阿霉素相比，可以显著降低毒性并保持原有的药效。该制剂的毒性、药代和药效实验结果将在后续文章中讨论。
参 考 文 献
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