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周雪晴，冯玉红，张 冲，林 强
（海南大学理工学院海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南海口 570228）
摘要：用超临界C02萃取技术，设计了4因素3水平正交实验，研究从海南催吐萝芙木中提取利血平生物碱的最佳工艺。最佳提取条件为：萃取压力35 MPa，萃取温度60℃，夹带剂为100g样品用25mL乙醇，萃取时间2h。用高效液相色谱法对萃取产物中的利血平含量进行了测定。将萃取所得产物用硅胶柱色谱进一步分离提纯，得到了质量分数为99.8％的利血平针状结晶。
关键词：超临界CO2萃取；柱色谱；利血平
传统中国药用植物萝芙木为夹竹桃科萝芙木属多种植物的干燥根及茎，具有清风热，降肝火，消肿解毒的功效，可用于治疗感冒发热、咽喉肿痛及蛇伤、跌打损伤等症。萝芙木的主要活性物质是利血平等生物碱类化合物。催吐萝芙木是引栽品种，已经在我国南方地区大量引栽种植，海南也有大面积种植，且有文献证明其利血平含量高于我国原产萝芙木。目前萝芙木生物碱提取方法主要是酸水提取法和有机溶剂提取法，但这些方法存在提取率低、药用有效成分含量低、有机溶剂残留等缺点。超临界萃取技术是一项集提取、分离、浓缩为一体的新技术，具有工艺过程简单，萃取温度低，选择性强，无溶剂残留，不破坏物质活性等显著优势，在医药及化工行业中得到了越来越广泛的应用。
本实验将超临界C02萃取技术与柱色谱分离技术结合，用于从海南催吐萝芙木中提取分离利血平生物碱，通过设计正交实验研究最佳萃取条件，柱色谱进一步分离纯制利血平。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
Spe—ed SPE型超临界流体萃取仪（美国ASl）；Pro star 高效液相色谱仪，配有紫外检测器（美国Varian）；laborota旋转蒸发仪（德国heidolph）；Esquire HCT质谱仪（美国Bruker）；400MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker）。
催吐萝芙木药材（采自海南）；液体CO2（佛山科的气体公司）；利血平对照品（中国药品生物制品检定所）；柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶G（青岛海洋化工厂）；色谱纯正己烷（美国TEDIA）；甲醇、氯仿、丙酮（均为广州化学试剂厂AR）。
1.2 方法
1.2.1 超临界CO2萃取
本文选取对超临界流体萃取效率有较大影响的4个因素：萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂用量，用正交实验进行优化考察，各因素各取3个水平，按正交表1进行实验。
称取粉碎后的催吐萝芙木根粉末200 g，装入萃取釜中，在一定温度和压力下进行超临界CO2提取，乙醇为夹带剂，萃取完毕，收集萃取物，备用。
1.2.2 利血平测定方法
（1）色谱条件
美国Varian Pro star液相色谱仪；手动进样器；色谱柱：u—Bondpak C18 3.9 mm × l00 mm不锈钢柱；流动相为V（甲醇）：V（水）=75:25；流速:1.5ml/min；检测器：UV；波长:254mm；外标法定量。
（2）标准曲线的制作
精密称取利血平对照品5 mg，置100 mL量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，分别精密移取1、2、3、4、5 mL于10mL容量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，在254 nm处测定吸光度，以吸光度与利血平质量浓度回归，得回归方程：Y=-0.0016+25.093X（R=0.9996），线性范围为0.5～15 mg／L-1。
（3）样品分析方法
收集不同条件下所得萃取产物，减压回收夹带剂，得浸膏，称取萃取物10mg于100mL容量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，得样品溶液。微孔滤膜 （0.45 μm）过滤后测定利血平的含量。
（4）回收率实验
称取样品6份，置100 mL容量瓶中，分别精密加入利血平对照品溶液，加氯仿稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，平均回收率为99.01％，相对标准偏差为1.51%。
1.2.3 放大实验
取2kg粉碎的催吐萝芙木根粉，在1 L萃取釜中进行放大实验，萃取压力为35 MPa，萃取温度为50℃，夹带剂为每100g样品用25mL乙醇，萃取时间2 h，收集萃取产物。
取萃取产物18g与适量硅胶拌匀，加入硅胶柱中不断洗脱，分段收集洗脱液，同时进行薄层色谱检测，合并组分相同的馏分。减压浓缩，并用甲醇进行重结晶，过滤后再用丙酮洗至白色，放置过夜，得针状白色结晶。
2 结果与讨论
2.1 正交实验结果分析
根据选定的L9（34）正交表安排实验，并对结果进行极差分析，可以看出，各因素对催吐萝芙木中利血平提取率的影响程度依次为A>D>B>C，最优的萃取方案是A3D2B3C2，即:萃取压力35 MPa，萃取温度60℃，夹带剂为每100g样品用25 mL乙醇，萃取时间2 h。
2.2 最佳工艺验证实验
取200g粉碎的催吐萝芙木根粉按最佳工艺条件A3D2B3C2进行验证实验，测得利血平的提取率为0.0920％，大于正交实验的最大值，说明优化是成功的。
2.3 分离产物测试分析
所得晶体为白色针状结晶，无臭无味，遇光色渐变深。易溶于氯仿，微溶于丙酮、甲醇等有机溶剂。用薄层色谱检测，与标准品对照，斑点位置重合。
核磁共振波谱有下列各特征吸收峰HNMR（CDCl3,TMS内标），δ:1.82（1H，ddd，H-14α），1.91（1H，ddd，H-20），1.98（1H，ddd，H-19β），2.05（1H，dddd，H-15），2.32（1H，d，H-14β），2.35（1H，ddd，H—19β），2.48（1H，dd，H-21β），2.69（1H，dd，H-16），2.96（1H，ddd，H-6α），3.06（1H，dd，H-21β），3.19（1H，d，H-5β），3.92（1H，dd，H-17），4.51（1H，dd，H-3），5.05（1H，ddd，H-18），6.77（1H，d，H-10），7.32（1H，d，H-9），3.92（3H，s，OCH3），3.83（3H，s，OCH3），3.50（3H，s，OCH3），7.32（2H，s，H—27*2），7.61（1H，br s，N-H）。
APCI-MS：m／Z=609（M+）。
上述理化数据均与利血平对照品一致。
3 结论
超临界C02从海南催吐萝芙木中提取生物碱的过程中，夹带剂的加入可大大改善萃取效果。正交实验结果表明，超临界C02萃取催吐萝芙木生物碱的最佳工艺条件为：萃取压力为35MPa，萃取温度为60℃，夹带剂为每100g样品用25mL乙醇，萃取时间2h。
超临界CO2萃取虽然能在一定程度上将萃取所得产物中的有效成分分离出来，但所含杂质仍然较多。本研究通过进一步的柱色谱分离，可将不同
成分依次分离出来，并可制备出质量分数为99.8％的利血平结晶，测试结果与对照品一致。
利血平为单萜吲哚类生物碱，具有生物活性，见光或受热易分解，超临界C02萃取可实现低温操作，且整个提取分离过程在暗场中进行，从而能够使其活性不被破坏，比传统的提取工艺更优越。结晶纯化过程中使用丙酮、甲醇为溶剂，取得了满意的结果。