摘要：DNA疫苗又称为核酸疫苗，是20世纪90年代初发展起来的一种全新疫苗，具有能够激发机体体液和细胞免疫反应，核酸疫苗因高效、持久、广谱、简便、廉价、无致病性等特点，被作为一种新型的疫苗而得到广泛的研究和应用，是近年来研究的一个热点。抗原编码基因的选择、质粒的构建、各种佐剂的应用以及疫苗接种方法和途径等因素可以提高和改变DNA疫苗的免疫效果与反应类型。DNA疫苗不仅有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。在不久的将来，DNA疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。
关键词：DNA疫苗；抗原基因；免疫机制
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的新型疫苗，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗(DNAvaccine)是由插入一种或多种外源基因的质粒DNA(来自细菌)和真核启动调控基因等元件构成的，载有外源抗原的质粒DNA在一种真核启动子和加尾信号以及相关增强子等基因单元的控制下，可在哺乳动物的各类细胞中表达出相关的抗原蛋白[1]。将重组有外源抗原编码基因的质粒，利用某种方法直接导入人或动物的细胞内，通过宿主细胞的转录系统，在被免疫对象机体的活体细胞合成抗原蛋白，从而诱导机体产生免疫应答。
1DNA疫苗的组成
DNA疫苗由病原抗原编码基因及质粒载体两部分组成。抗原基因可以是单个基因或完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗载体质粒一般以质粒为基本骨架。常用的质粒载体有pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1等。这些源于大肠埃希菌的质粒载体可在真核细胞中表达外源基因，理论上，它们的结构包括两种不同的单元促使抗原合成的转录复合单元，一套用于表达大肠埃希菌，另一套用于在宿主细胞内表达。它含有一启动子/增强子，带有功能性剪接供体和受体位点的内含子，编码抗原蛋白的基因序列以及多聚polyA加尾信号，启动子多采用CMV、SV40、RSV、LTR及肌动蛋白启动子序列，它们都具有较高的转录活性，在多种动物细胞中能高效表达；原核细胞元件，如复制起点、多克隆位点以及有利于重组载体的构建并可加速其在细菌中增殖和扩增的选择标志，且质粒的基本骨架中还有促T细胞激活的免疫刺激序列(ISS)[2-3]。
2CpG免疫刺激的作用
DNA疫苗中具有免疫刺激活性的结构基础是非甲基化的CpG基序(CpGmotif)，又称为免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS)。
目前，寡核苷酸免疫刺激机理尚不清楚。含有CpG序列的寡核苷酸可刺激鼠B细胞增生和免疫球蛋白的产生，并可在体内及体外诱导T、B细胞和自然杀伤细胞分泌某些细胞因子，如IL-6、IL-12和IFN-γ。寡核苷酸的免疫调节作用与序列结构有关，一般认为B细胞有效的活化须具有5′端两个嘌呤、3′端两个嘧啶的CpG基序，能够序列特异性和非序列特异性地结合血清中的病毒和细胞蛋白，并非特异性地激活转录因子Spl[4]。CpG基序可诱生细胞毒性T淋巴细胞，这可能是因B细胞的活化促进了共刺激分子(CD86和CD25)的表达，或因CpG基序改变了T细胞对T细胞受体活化信号的敏感性而造成。Sato等发现，将β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因整合入含卡那霉素抗性基因的质粒后，表达β-Gal的水平比整合到含氨苄抗性基因的质粒要高，但诱导的抗β-Gal的抗体水平则相反。进一步研究发现，氨苄抗性基因中含有两个重复的未甲基化的AACGT序列，而卡那霉素抗性基因则没有。将此序列插入含卡那霉素抗性基因的质粒载体中可提高诱生抗β-Gal的抗体水平，并有效地诱导产生了较高的IgG、CTLs和IFN-γ。AACGT是已经证实了的具有免疫刺激活性的CpG基序，因此人们设想可以把DNA疫苗结构分为编码抗原区和骨架区，期望可以通过增加骨架结构中的免疫刺激CpG基序提高疫苗的免疫效果，但还需更多研究[5-7]。
研究发现CpG基序常以PuPuCpGPyPy的形式出现于细菌基因组DNA序列和质粒中，出现频率为1/16；而脊椎动物中较少，出现频率为1/50。原核细胞CpG中的胞苷酸的甲基化不足5%，而真核则达70%～90%。对于脊椎动物免疫系统来说，能够识别原核生物DNA中以未甲基化的CpG为核心的CpG序列，产生免疫激发，而且针对CpG两侧不同的脱氧核苷酸顺序分泌不同种类的细胞因子。
3DNA疫苗的免疫应答机制
DNA质粒被导入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，再经过加工、处理、修饰递呈给免疫系统，激发免疫应答。这一过程类似于病原
微生物感染或减毒活疫苗接种，所以DNA疫苗能有效地激发体液免疫和细胞免疫，尤其是其具有激活杀伤性T淋巴细胞的作用。
3.1细胞介导的免疫反应
3.1.1MHCⅠ途径DNA疫苗接种机体后，质粒被周围细胞摄取并被细胞质中的酶复合物-蛋白酶体所降解，形成9个～13个氨基酸的肽段，然后经抗原转运蛋白(TAP)转运至内质网腔进一步修饰成8个～10个氨基酸的短肽。这些短肽(抗原表位)片段在内质网腔与新合成的MHCⅠ分子的抗原结合槽相结合，形成抗原肽-MHCⅠ分子复合物，并经高尔基体转运至细胞表面作为免疫原信号供CD8＋CTL所识别，导致其活化、增殖并分化为具有杀伤能力的效应CTL(Tc)，诱导产生较强的细胞免疫反应[3,9]。这些效应Tc细胞可以类似于NK细胞的机制，通过释放穿孔素和颗粒酶杀死病毒感染的细胞，使其发生溶解从而限制病毒感染的扩散。此外，效应CTL还可通过产生细胞因子等非溶细胞机制来抑制病毒。
目前认为，DNA导入皮肤后，由于肌细胞是不可再分裂的细胞，因此质粒可在肌细胞中长时间保留从而使外源DNA得以长期的表达。此外，由于肌细胞几乎包括所有类型的细胞，如专职抗原递呈细胞(朗罕氏细胞、树突细胞)等，因此肌细胞都可以摄取和表达抗原，或接受邻近其他细胞递呈的抗原，再递呈给组织内同样较丰富的Th和CTL细胞[10]，或邻近的淋巴组织。这可能也是皮肤导入途径通常只需要极少量外源DNA的原因。但是肌细胞MHCⅠ分子的低表达使人们对其抗原递呈的能力表示怀疑。Ulmer等利用体外转染的方式将含有抗原基因的成肌细胞移植于同系小鼠的肌肉内后发现其能够有效激活CTL活性，并诱导产生了相应抗体；同时，他将此H-2k背景的成肌细胞接种到H-2d×H-2k杂交一代小鼠发现：激活的CTL不仅具有H-2k限制性识别，同时也具有H-2d的限制性识别。因而，他认为肌细胞表达抗原足以激活机体产生有效免疫，同时邻近的肌细胞亦可以获得其传递的抗原并进行递呈，从而激活机体的免疫应答。进一步的试验证明髓源的抗原递呈细胞(APC)亦参与特异性CTL的诱导，且效率高于肌细胞。
在骨髓重构试验中，注射F1-骨髓重构鼠中的亲本细胞在单倍型体细胞和骨髓源细胞间产生错配；DNA接种后的免疫反应对重构骨髓的单倍型有严格的限制。这些结果清楚说明骨髓源性细胞在DNA接种后的免疫反应激活中起着非常关键的作用
髓源性的APC(如树突状细胞，巨噬细胞等)可以通过两条途径参与抗原递呈：①经肌肉注射的质粒DNA直接被周围的APC(包括局部的组织细胞、专职APC或其他有核细胞)摄取，使质粒携带的抗原基因得以在APC内表达，经加工处理后进人MHCⅠ类分子限制性的抗原递呈途径；②质粒DNA经肌细胞摄取后，在其内加工合成的抗原通过某种方式传递给APC，而后再进入MHCⅠ类分子的抗原递呈途径[14]。
3.1.2MHCⅡ途径MHCⅡ类分子的α与β链在内质网中与Ii链(invariantchain)非共价结合，Ii链与MHCⅡ分子的抗原结合部位的结合有效阻止了胞质中未成熟的内源性抗原与MHCⅡ类分子的结合。Ii与MHCⅡ类分子结合形成的复合体经高尔基体转运至内体(endsome)，在某些蛋白水解酶和低pH条件下Ii链与MHCⅡ类分子发生解离。外源蛋白降解成至少含13个氨基酸的肽段，通常为17个氨基酸。这些短肽片段(抗原表位)再与MHCⅡ类分子结合，形成抗原肽-MHCⅡ类分子复合物，被递呈至抗原递呈细胞表面，为辅助T淋巴细胞(Th细胞)所识别，导致Th细胞活化、增殖、分化为效应Th细胞，并分泌一系列的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-2、TNF等)，从而发挥Th细胞的辅助效应。辅助T淋巴细胞有两类：Th1主要介导细胞免疫反应，活化巨噬细胞的产生；Th2主要介导体液免疫反应，诱导B淋巴细胞的活化及抗体的产生。
3.2体液免疫
DNA疫苗激活B细胞反应较T细胞反应滞后，这是因为抗体的产生有赖于完整抗原被B细胞所识别，而抗原进入细胞表面或间隙是被B细胞识别的前提。异源抗原被B淋巴细胞表面的免疫球蛋白所识别后，启动受体介导的内吞作用，被吞入的抗原分子经水解成为免疫原性多肽，与MHCⅡ类分子结合后表达于细胞表面，并递呈给CD4＋T细胞，促使其活化并分化为Th2细胞，产生IL-4、IL-5和IL-6及CD40的配体分子。在Th2型细胞因子的作用下，B细胞活化、增殖、分化为浆细胞，合成并分泌抗体，产生体液免疫应答。产生的抗体主要为IgG，此外还有少量的IgM和IgA。对甲型
流感病毒的研究发现，用保守核蛋白(NP)接种小鼠所产生的抗血清对病毒复制无抑制作用，而接种NP质粒的小鼠获得的抗血清可有效地抑制病毒复制。可见，基因免疫接种和抗原免疫接种所获得的体液免疫在质和量上存在一定差异。
4DNA疫苗的优点与安全性
DNA疫苗作为第3代疫苗，具有其自身的特点。
4.1DNA疫苗的优点
4.1.1易操作性和稳定性对于质粒来说，不管其编码序列如何，都可用相同的方法纯化和处理，并且干燥的DNA质粒在室温下相对稳定，这一点决定了DNA疫苗在热带地区应用的优越性。另外，由于其易操作性和稳定性，也决定了DNA疫苗生产成本相对低廉，这就为DNA疫苗在发展中国家的大规模使用铺平了道路。
4.1.2免疫效果好DNA疫苗在宿主细胞内表达，其加工处理过程与病毒感染的自然过程相似，抗原递呈过程也相同，从而以自然的形式被加工后以天然构象递呈给宿主的免疫识别系统，激发较强的免疫应答。
4.1.3重组质粒DNA在宿主体内存在时间长持续刺激机体产生广泛的体液免疫应答和细胞免疫应答，产生持久免疫。选择核心蛋白保守DNA序列制备基因疫苗，避免免疫逃脱现象。同时DNA疫苗能刺激黏膜免疫发生，诱导免疫记忆反应[15-18]。
4.1.4DNA疫苗可用于
癌症等疑难病症的治疗研究表明，向小鼠体内注射编码抗体可变区基因的质粒可产生独特型抗体，抗体可变区基因疫苗可用于治疗B淋巴瘤。有人把编码人癌胚抗原(CEA)的质粒注入到小鼠舌中之后，引起了针对CEA的特异性细胞免疫和体液免疫，这一结果为治疗人类结肠癌、
乳腺癌和
肺癌等疾病带来希望。
4.1.5DNA疫苗可用于变异频繁或血清型较多的病原免疫预防DNA疫苗在对变异频繁或血清型较多的病原免疫预防过程中，对于目前多价活毒疫苗防治的疾病预防和治疗有重要意义。易变异的病原如流感病毒、轮状病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒。
4.1.6质粒DNA无免疫原性，可以反复使用这一特点对具有母源抗体的动物尤为重要。
4.2DNA疫苗的安全性
DNA疫苗具有传统疫苗所没有的优越性，但是真正运用于人体还有许多问题有待解决。
载体DNA整合到宿主基因组内，有导致不利转化的可能，如通过癌基因的插入，导致宿主原癌基因的插入活化或抑癌基因的失活等，如果基因疫苗散布到生殖细胞，并发生整合，则影响更为深远[18-22]。
免疫效果有待提高。实验动物越大，基因免疫效果越差，在小鼠试验中，检测到抗体反应高，而到其它大型的动物效果就不是很明显。
抗DNA免疫反应。质粒DNA会不会诱发抗双链DNA的自身免疫反应，可能引起自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮)，正常人体中可以存在抗菌ssDNA和dsDNA抗体，而不存在抗自身的dsDNA抗体。利用细菌DNA免疫接种，可以诱导产生抗哺乳动物ssDNA抗体，但无抗哺乳动物dsDNA抗体的。还有DNA疫苗中含原核基因组中常见的CpG基序，易形成抗原决定簇[21]。
5结语
DNA疫苗开创了免疫学和疫苗学的新领域。越来越多的试验研究发现，DNA疫苗在免疫防御方面有良好的效果，但DNA疫苗还面临着许多挑战，比如DNA疫苗接种的免疫学机理，有关核酸疫苗在理论上的安全性问题等方面，还需要进一步的试验加以阐明。
现在普遍认为，DNA疫苗应先用在传统方法无法对付的病原体和疾病上。如HIV、肺
结核、疟疾、
乙肝、
丙肝、流感和支原体等。在另一个方面，DNA疫苗的优势是它的治疗作用。相信随着研究的深化，DNA疫苗将会逐一解决现有的问题，在更多的领域中发挥作用。
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