香丹注射液的指纹图谱研究

摘要:目的：建立香丹注射液指纹图谱。方法：利用气相色谱、高效液相色谱、气质联用仪和液质联用仪对香丹注射液分析。结果：建立了香丹注射液指纹图谱的分析方法和确定了气相色谱和液相色谱指纹图谱中部分主峰的结构。结论：该分析方法能有效地控制香丹注射液的质量。
关键词:香丹注射液;指纹图谱;气相色谱;高效液相色谱
香丹注射液是由水蒸气蒸馏的降香饱和水溶液与丹参水提液配制而成的,临床上用于治疗心绞痛、心肌梗死等疾病。药理研究表明香丹注射液能减轻急性心肌缺血的损伤程度, 并加速心肌缺血或损伤的恢复。现行的中药质量控制模式是沿用测定中药某一有效成分为目标的分析方法。这种质量控制模式忽视了中药中各组分相互影响的本质,因而具有局限性。作为一种全新的中药质量控制模式,中药指纹图谱能够更全面地、更精确地控制中药注射液的质量。本实验针对香丹注射液的特点,建立了香丹注射液的气相色谱和高效液相色谱指纹图谱分析方法, 并对所建立的方法进行了方法学考察。此外根据各色谱峰质谱图以及标准对照品法对其组分进行定性,进一步认识了香丹注射液指纹图谱的本质。
1　仪器与试药
Microm ass GCT气相色谱/飞行时间质谱仪(英国质谱公司),Agilent 1100液相色谱,Micromass LCT 液相色谱/飞行时间质谱仪(英国质谱公司),PHSJ-4pH 计(上海雷磁仪器厂)。
香丹注射液(市售);氦气(高纯);甲纯、乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯;丹参素(批号1108552200203)、原儿茶醛(批号1108102200205)、原儿茶酸(批号8092200102)、阿魏酸(批号077329910)、咖啡酸( 批号8852200102)、丹参酮ⅡA(批号07662200213)、隐丹参酮(批号85229903) 对照品由中国药品生物制品检定所提供。
2　方法与结果
2.1　气相色谱分析供试品溶液的制备:准确量取香丹注射液10mL,加10mL二氯甲烷萃取3次,合并萃取液,自然挥干至一定质量浓度,加1mL六甲基苯内标溶液于浓缩液中,自然挥干到约0.5mL,作为供试品溶液。
2.2　液相色谱分析供试品溶液的制备:香丹注射液经微孔滤膜滤过,直接进样。
2.3　气相色谱指纹谱内标物溶液的制备:准确称取六甲基苯约4mg,用二氯甲烷溶于10mL量瓶中,并加至刻度, 移取0.5mL到10mL量瓶中,用二氯甲烷稀释至刻度,备用。
2.4　高效液相色谱指纹谱内标物溶液的制备:精密称取3.9mg阿魏酸对照品于10mL量瓶中,用水溶解, 并加至刻度, 即得。
2.5　气相色谱-质谱联用分析条件:气相色谱条件:色谱柱:DB-5MS毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm) ; 柱温: 80℃(2min)～240℃,3℃/min;气化室温度:280 ℃; 氦气流量:0.7mL/min;分流比:1∶1。质谱条件:电离方式为电子轰击(EI);电离能量:70eV;离子源温度:180℃。
2.6　液相色谱-质谱联用分析条件: 液相色谱条件:
色谱柱: Inersil C18柱(150mm×4.6mm,5μm);柱温:30℃; 流动相:A液(pH2.5三氟醋酸水溶液),B液(乙腈);梯度:0～35min,0%B～25%B;35～60min, 25%B～30% B;波长:280nm;体积流量:1mL/min;进样量: 10μL。质谱条件: 汽化室温度为400℃;离子源温度:150℃;雾化气流速:300mL/min;锥孔电压:66V;毛细管电压:3500V。
2.7　香丹注射液气相色谱指纹图谱及方法学考察:香丹注射液气相色谱指纹图谱图。选用了7个组分,以S为内标,对此方法进行方法学考察。
2.7.1　稳定性试验: 取同一供试品溶液,分别于0、2、8、16h进样测定。以六甲基苯相对峰面积为1,主要组分相对峰面积的RSD小于5.0%。
2.7.2　精密性试验: 取同一供试品溶液,连续进样4次,以六甲基苯相对峰面积为1,主要组分相对峰面积的RSD小于5%。
2.7.3　重现性试验: 取同一批号香丹注射液4份,分别处理测定。以六甲基苯相对峰面积为1, 主要组分相对峰面积的RSD小于5.5%。
2.8　香丹注射液变效液相色谱指纹图谱及方法学考察:根据高效液相色谱条件,得香丹注射液高效液相色谱指纹图谱图。以参照物阿魏酸对应的色谱峰(S)的相对保留时间及峰面积为1,选用了13个组分对此方法进行方法学考察。
2.8.1　精密性试验: 取供试品溶液连续进样5 次,按以上方法香丹注射液高效液相色谱指纹谱各色谱峰的相对峰面积和相对保留时间RSD均在2%内。
2.8.2　稳定性试验: 取供试品溶液分别在0、2、8、16h 进样测定, 结果高效液相色谱指纹谱各色谱峰的相对峰面积和相对保留时间RSD 均在3% 内。
3　讨论
3.1　气相色谱指纹图谱部分
3.1.1　预处理方法的选择:根据实验结果,香丹注射液不适合于顶空处理。因为香丹注射液中降香挥发油组分极其微量, 致使顶空处理无法收到较好的效果。因此香丹注射液气相色谱样品预处理采用有机溶剂萃取。
3.1.2　萃取溶剂的确定: 实验过程中选用了3种溶剂(乙醚、二氯甲烷和正己烷)处理香丹注射液。从萃取的效果看,乙醚与二氯甲烷相近,但都优于正己烷,挥发性组分在正己烷中的溶解性较差,二氯甲烷能够萃取得到香草醛,乙醚萃取液中未能找到香草醛。根据萃取过程的简易程度, 二氯甲烷做萃取剂时不易乳化、层次分明和省时。乙醚萃取时则较易乳化, 使得操作过程烦琐, 重现性差。因此二氯甲烷适合萃取香丹注射液中挥发油的组分。
3.1.3　香丹注射液中挥发油成分组成: 经GC-MS分析, 香丹注射液中存在少量的香草醛、苦橙油醇和4种氧化苦橙油醇。
3.1.4　本实验针对香丹注射液中挥发油组分建立了香丹注射液的气相色谱指纹图谱的分析方法,并对此分析方法进行方法学考察, 各峰相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差除个别峰外均小于5% ,表明该法适合于香丹注射液气相色谱指纹图谱的分析。
3.2　液相色谱指纹图谱部分
3.2.1 　pH值对分离的影响: 采用pH 2.25、2.5、3.0流动相对香丹注射液液相色谱分离进行考察,发现流动相pH值越低,分离效果越好。但考虑到色谱柱的pH极限,本方法选用pH2.5的流动相。
3.2.2　三氟醋酸与磷酸对分离的影响: 考察了三氟醋酸与磷酸对香丹注射液分离的影响, 结果表明流动相中添加三氟醋酸比磷酸分离效果好。
3.3　香丹注射液中组分的定性: 实验采用对照品、紫外光谱法和液相色谱2质谱法对香丹注射液各组分进行定性, 香丹注射液中存在丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸A、2 种丹酚酸B 异构体、丹酚酸C。综合上述结果, 将香丹注射液指纹图谱划分为4部分: 多羟基酚类化合物及鞣质类化合物、小分子酚酸化合物、丹酚酸类化合物和脂溶性化合物。