合成熊果苷的色谱指纹图谱分析

摘要：建立了合成熊果苷的高效液相色谱-紫外光谱-质谱指纹图谱,发现熊果苷产品中主要存在两种杂质:原料对苯二酚和一种副产物,并对它们进行了定量分析。根据样品指纹图谱的整体相似程度估算了熊果苷杂质组成和含量的整体波动程度,据此可以方便准确地控制产品质量的一致性和稳定性。
关键词：熊果苷，对苯二酚，高效液相色谱，紫外光谱，液相色谱-质谱联用
    中间体的生产是发展精细化工的基础,目前中间体在精细化学品市场占有超过60 %的份额,而为高端精细化学品度身定制的中间体具有相当高的利润率。中国正在成为世界上中间体的重要生产基地。中间体参与国际市场竞争的最重要的砝码是质量,产品质量未能得到有效的控制,一个重要的原因就是产品分析测试水平低下,造成时好时坏,影响客户的下游生产。为此,作者提出借鉴中药指纹图谱的经验,以杂质组学( Impuritomics) 的研究方式,建立精细化工中间体的色谱指纹图谱(Chromatographic fingerprint) ,作为控制中间体质量的一个关键指标。其定义为:精细化工中间体色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴别和测定手段。借助中间体中的杂质组学,控制中间体中杂质的种类及其含量,保证原料、中间产物和最终产品质量的一致性和稳定性,并符合法规或协议。其基本属性是“整体性”和“明确性”。本文是精细化工中间体色谱指纹图谱构建策略的一个实例。
    熊果苷(对羟基苯- β- D - 吡喃葡萄糖苷, p -hydroxyphenyl - β- D - glucopyranoside ,arbutin) 是从植物中分离得到的一种成分,具有镇咳、利尿、抗菌、消毒等生物活性。近年来还发现熊果苷能有效抑制皮肤细胞中的酪氨酸酶,从而显著地减少皮肤中的色素沉积,可以祛除色斑和雀斑。目前,以熊果苷作为化妆品添加剂是一个新的热点,但从植物中提取熊果苷工艺复杂、产率低、成本高。以葡萄糖和对苯二酚为原料,用人工合成的方法制得的熊果苷克服了以上缺点。熊果苷的应用非常广泛,定量测定熊果苷的方法有较多报道,但测定熊果苷中对苯二酚及其它杂质含量的方法未见报道,而杂质的分布和含量同样是决定产品质量的重要因素。酚类物质对人体有很大的危害,由于渗透性强,可以通过皮肤、呼吸道粘膜、口腔等多种途径进入人体,并深入到内部组织,侵犯神经中枢,刺激骨髓,严重时可导致全身中毒和致癌,长期接触酚类物质还会出现皮肤疡痒、皮疹、贫血、记忆力减退等症状。因此国际市场上对熊果苷中对苯二酚的残留量有着严格的限制。用高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV) 定量测定了熊果苷样品中对苯二酚的含量,同时,用液相色谱-质谱联用(LC-MS) 的方法初步推断出熊果苷中一种主要未知杂质的可能结构式。通过对10 个不同批号熊果苷产品中杂质的测定,数据分析和统计,从而建立了熊果苷色谱,并利用相似度计算方法(欧氏距离) 对产品进行质量评价,可用于指导合成和纯化,控制产品质量。
1 实验部分
1. 1 　仪器与试剂
    Waters Alliance 2695 型高效液相色谱仪,配备真空脱气机,四元梯度泵,自动进样器,996 型二极管阵列(PDA) 检测器。色谱分离系统的控制和记录由Waters Millinium32色谱工作站完成。
Agilent 1100 LC-MSD 系统,配备电喷雾离子源(ESI) 在线真空脱气机,二元高压梯度泵,恒温自动进样器,二极管阵列检测器。系统的控制和记录由Agilent 化学工作站完成。
    熊果苷对照品和样品(江苏鑫源生化科技发展有限公司) ;对苯二酚为分析纯;甲醇为色谱纯;冰乙酸为分析纯;高氯酸为优级纯;水为娃哈哈纯净水。
1. 2 　操作条件
    HPLC-色谱柱: Waters 公司的SymmetryC18(5μm ,4. 6 ×250 mm) ;流动相:甲醇/ 水/ 乙酸水溶液(体积浓度为1 %) = 5∶45∶50 ;流速:0. 8 mL/ min :柱温:30 ℃;检测波长:287 nm;进样量:10μL 。
    LC-MS-正离子模式ESI( + ) ;扫描范围(m/ z) :50～600 ;传输电压:70 V ;干燥气(N2) 流速:10 L/ min ;喷雾气(N2) 压力:68. 78 kPa ;温度:350 ℃: 毛细管电压:400 V。
2 结果与讨论
2. 1 　样品的色谱图和质谱图
    在样品的色谱图(图1) 中,通过标准品对照可知峰2 为熊果苷,峰3 为对苯二酚。用液—质联用确定峰2 为熊果苷(图2) ,峰1 为未知杂质,对苯二酚的质谱峰没有出现,这是因为酚类物质在正离子ESI 模式下响应很小的缘故。
2. 2 　样品中对苯二酚含量的测定
    准确称取对苯二酚标准品10 mg于10 mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀,得标准储备液(浓度为1. 0 mg/ mL) 。分别精密移取储备液适量用水配成标准溶液系列(浓度为0. 000 04～0. 01 mg/ mL) ,各取10μL 进样。以峰面积为纵坐标对浓度作图,得线性良好的标准曲线,相关系数为0. 999 92 ,回归方程为A (area) = - 638. 430 7 + 1. 494 98 E7 C。当信噪比S/ N = 3 时,测得对苯二酚的最低检测限为0. 000 02mg/ mL 。准确称取5 份熊果苷样品约10 mg ,分别置于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,制成5 份样品溶液。每份溶液分别取10μL 各进样5 次,单份溶液分析结果见表1。5 份熊果苷样品中对苯二酚的平均含量为0. 012 7 % ,相对标准偏差(RSD) 为4.6 %。
2. 3 　样品中未知杂质的鉴定
    按质谱图(图2) ,对应于色谱图1 中峰2 的分子离子峰[M + NH4 ] + , [M + Na ] + , [M + K] + 分别为290. 1 ,295. 1 ,311. 0 ,说明该物质的相对分子质量为272 ,即熊果苷:对应于色谱图1 中峰1 的分子离子峰[M+ NH4 ] + , [M + Na ] + , [M + K] + 分别为452. 1 ,457. 1 ,474. 0 (图3) ,可知该未知杂质的相对分子质量为434 ,根据熊果苷的合成路线推断它的分子式为C18H26O12 (可能的结构式有多种,比如图4 中的a ,b ,c ,d) ,其中a ,b ,c 是葡萄糖分子在反应前先二聚或转型后二聚得到二糖,再与对苯二酚反应得到的产物,这些产物在文献中均已有报道,它们在化妆品中的功效与熊果苷类似,甚至更强; d 是由两个葡萄糖分子分别与对苯二酚分子中的两个羟基反应生成的产物,在文献中尚未见有报道。限于熊果苷样品中该未知杂质的量极低,我们尚不能判断其准确结构,但这对指纹图谱的建立没有影响。
2. 4 　熊果苷的指纹图谱
2. 4. 1 　不同批号熊果苷样品的指纹图谱的比较不同批号的10 个熊果苷样品的色谱指纹图谱如图5 所示,从图中可以看出,熊果苷样品的图谱较为相似。我们从中选出3 个共有峰作为其特征峰(见图1) ,其中峰1 可依据质谱鉴别,相对分子质量为434 (图3) ,峰3 对苯二酚则借助紫外光谱(图6 - b) 定性。这些峰在所有的样品都有,但也存在差异,见图5。
2. 4. 2 　相似度计算
    图1 中的主峰(峰2) 是熊果苷,我们主要考虑杂质峰的差异,对10 个批号熊果苷样品的两个杂质峰进行积分,得到峰面积。对苯二酚的百分含量通过对照品由外标法得到,而峰2 代表的杂质(C18H26O12) 由于没有标准物质,用其峰面积与主峰面积之比( %) 表示,然后据此计算欧氏距离相似度,结果见表2。
    在满意相似度的基础上,再进行其它指标的测定,可以确保产品质量的稳定性和一致性。
2. 5 　高效液相色谱条件选择
2. 5. 1 　流动相的选择
    考虑到熊果苷和对苯二酚在结构上都有酚羟基,在水溶液中容易离解导致峰型畸变,无法分离,用1 %的乙酸溶液或0. 2 %的高氯酸溶液抑制其离解,效果均比较好,峰形比较尖锐,但由于高氯酸难挥发,不适合做液相色谱—质谱联用,而乙酸做液-质联用不存在这个问题,因此本实验在流动相中选用乙酸而不用高氯酸。经过试验,当V甲醇∶V水∶V1 %水溶液= 5∶45∶50 时,各成分能在适宜时间内得到清晰的分离。
2. 5. 2 　检测波长的确定
    对照熊果苷和对苯二酚的紫外吸收图,考虑到待测对苯二酚的含量较低,选择对苯二酚吸收较强的波长287 nm 作为检测波长。
3 结　论
    本文建立了用高效液相色谱测定合成熊果苷中对苯二酚含量的方法,还通过LC-MS 联用技术得到了熊果苷中未知杂质的分子式,并初步推断了它的可能结构式。本方法操作简单,结果准确可靠,适合同时测定熊果苷及其中对苯二酚和其他杂质的含量,进而建立了熊果苷的指纹图谱。
    精细化工中间体指纹图谱可以被视为产品质量的一个特征性指标,如果一个样品指纹图谱出现了严重偏离,显示产品质量出现了问题,其它的质量指标就可以不用再去测试,指纹图谱在精细化工中间体质量控制方面具有不可替代的地位。