中药指纹图谱的构建与解析

中药是中华民族的宝贵财富，它的疗效已为世人所瞩目。然而众所周知在我国中药材的质量极不稳定，市场也较为混乱。中药的质量问题已成为中药现代化、国际化的一大障碍。 多年以来中药材质量控制基本上是以传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别评价优劣。前者属于定性分析且需要鉴定者具有丰富的实践经验，人为影响因素较大，后者只考虑众多复杂成分中的个别“活性成分”，而忽略了中药材诸多成分间的协同作用。随着现代分析技术的发展，把已知的主要或有药效作用的成分，作为指标予以检测控制，这比过去有了很大进步．但是从传统中医药理论的观点来看，指标成分的控制难以真正控制中药的质量。目前国际上已认可用中药指纹图谱来作为控制中药质量的质控模式。用中药指纹图谱监控中药质量，并不要求指纹图谱中的每一个组分都清楚，也不要求对每一个组分都精确测定，但要求图谱具有指纹特征，即要求专属、稳定、实用。中药指纹图谱研究包括中药材或中成药指纹图谱的获得和指纹图谱的分析、应用两方面。本文以近年来国内外在指纹图谱的构建和解析方面的研究为材料，综述了构建和解析指纹图谱的各种方法，并比较了它们的适用范围。 1指纹图谱的构建 目前获得指纹图谱的主要手段是色谱法和光谱法，其中比较常用的有以下几种 1．1 薄层色谱法 薄层色谱法常用于中药中各种成分的鉴定。薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，具有更好的指纹鉴别意义。运用薄层扫描法已获得了黄连、黄芩等中药的指纹图谱，还获得了高良姜中黄酮类成分的指纹图谱，同时薄层扫描法还可用于成药的分析，如六味地黄丸中各味药的鉴定。但由于薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，会引起一定的实验误差。 1．2 高效液相色谱法 高效液相色谱法是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。 配置紫外检测器的高效液相色谱在指纹图谱构建中较为常用，如贾晓斌等采用梯度洗脱制定了复方人参注射液的指纹图谱；赵燕燕等进行白茅根氯仿提取液的指纹图谱研究，由指纹图谱可判定其正伪，但对目前所知的白茅根药材中保肝利尿的主要有效成分葡萄糖和钾盐则无法检测，因此其指纹图谱只能用于定性鉴定其正伪，而不能确定其质量的优劣。应用光电二极管阵列检测器(DAD)构建指纹图谱的研究也较多，如黄芩中黄酮类成分指纹图谱的确定；侯艳鹏等在不同来源旋覆花药材指纹图谱研究中还发现仅比较色谱峰的保留时间是不够的，还需校对峰的紫外光谱是否一致。对于无紫外吸收的中药或其制剂可改用其它检测器，如蒸发光检测器(ELSD)等。如注射用七叶皂甙钠用HPLC分离，用ELSD检测，得到的指纹图谱直观准确地反映了产品质量，但ELSD的使用受样品组分和流动相挥发性的影响。液质联用技术可提供大量信息，符合解决中药复杂体系的要求，已用于指纹图谱的构建中，如桂枝汤A部分指纹图谱的确定及比较；张尊建等采用HPLC-UV-MS法对丹参药材、丹参注射液中间体及丹参注射液进行指纹图谱研究，得到了分离度好的指纹图谱。但由于液质联用仪价格昂贵，推广应用有一定的困难。 液相色谱具有重现性好、稳定性好的优点，适宜于构建指纹图谱。由于药材和成药不能直接进样，需经提取纯化，在考察条件时要避免只对“指标成分”予以考虑，而忽视“非指标成分”，对于中药注射剂应尽量采用直接进样、梯度洗脱，以避免上述偏差。又由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱也需要加以考察。 1．3 气相色谱法 气相色谱法适合于挥发性药材及制剂的指纹图谱研究。构建指纹图谱时一般使用质量型检测器—氢火焰离子化检测器(FID)。苏薇薇等对中成药乌鸡白凤丸石油醚提取物进行了气相色谱分析，获得的指纹图谱可作为乌鸡白凤丸质量评价的标准。钱浩泉等用气相色谱法建立了高良姜及其近缘植物挥发油成分的指纹图谱。赵陆华等用挥发油提取器对降香进行提取，用十四醇为内标，建立了降香药材的指纹图谱。在中药复方制剂上，冯毅凡等对华佗再造丸及其主要药味的石油醚提取液进行了气相色谱分析，获取其气相色谱指纹特征，可作为成药及其原料药真伪鉴别的依据。而GC-MS联用，不仅具有GC的高分离效能，而且兼备了MS鉴定的高灵敏性和准确性。苏薇薇等对45个细辛样品进行了GC-MS分析，经PRIMA法处理，实现了计算机对多种细辛的分类鉴别；魏刚等采用GC-MS法对不同产地广藿香、组织培养广藿香以及超临界提取广藿香、广藿香对照品共21个样品进行主成分分析，并建立了指纹图谱。 1．4毛细管电泳技术 毛细管电泳已用于中草药中生物碱、黄酮／黄酮苷、酚酸、香豆素、醌类、强心苷、葡萄糖异硫氰酸盐等物质的分析。龙虹等报道了金银花、银黄口服液和双黄连的毛细管电泳图谱，均含较多未知峰，指纹特征好；赵霞等以毛细管区带电泳模式，用内标法分析了9种贝母药材中生物碱的含量；王刚力等采用HPCE的MECC分离模式对18个卷柏属植物样品的乙酸乙酯提取物进行测定，建立了18个样品的指纹图谱。由于指纹图谱构建中样品的预处理以获得尽量多的指纹特征为前提，而毛细管电泳可以对大小分子、解离非解离分子同时分析，故适宜中药指纹图谱构建。 1．5红外光谱法 红外光谱法研究指纹图谱可用于药材鉴定，如甘草、延胡索与全叶延胡索、苍耳子与东北苍耳子、粉葛与野葛等药材的鉴别。红外光谱法还用于成药的鉴别，如田进国等对同仁乌鸡白凤丸与消栓再造丸红外指纹图谱的研究，结果两样品都具有独特而稳定的红外指纹图谱，可作为质量控制和真伪鉴别的依据。矿物类中药可直接压片测定其红外光谱，禹余粮有褐铁矿结核和普通褐铁矿两种，两者的化学成分相同，光学性质相似，而其红外光谱有很大区别。红外光谱是由分子的振动—转动跃迁引起的，确定其专属性和特征性有较大困难。 1．6紫外光谱法 紫外光谱是电子光谱，形状变化不大，有时不同的化合物有相似的图谱，专属性差。故紫外光谱法较少应用于指纹图谱的构建中。 1．7分子生物学方法 不同生物体有各自相对稳定的DNA序列，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图谱。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术和随机扩增多态DNA(RAPD)是目前最常用的构建DNA指纹图谱的方法。但RFLP技术繁琐，要求的DNA量大，实验材料必须新鲜，因此其应用受到限制；而RAPD法可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下检测DNA的多态性，具有灵敏度高、多态性强的优点，同时分析的是基因型而非表现型，结果不受材料来源、环境因素、样品形态等影响，为干燥药材鉴定提供了更加准确的手段。罗志勇等E361采用RFLP技术，分析了人参、西洋参基因DNA指纹图谱。刘塔斯等采用RAPD方法对3个产地玉竹及其2种混淆品进行分析，准确区分了正品与混淆品。但RAPD法的重复性差等问题引起了许多争议。而且，色谱法与DNA指纹图谱相比其优点在于：不但有特征的体现(各种化学成分的个数和相对位置一保留时间)可作定性鉴别使用，还可体现量的概念。 2指纹图谱的解析 对两张色谱指纹图谱仅靠人们的主观比较很难客观、公正、科学地判断它的相同、相似或不同，往往由于人为的主观误差可能做出不同判断，缺乏科学的评判标准。另外色谱图 中各色谱峰的保留值常会受各种因素的影响，包括一系列的操作因素，甚至色谱柱本身在实验过程中的变化。又因为中药是生物样品，存在明显的个体差异，同种中药会出现不同色谱峰，不同种有时会出现相同色谱峰。所有这些都给指纹图谱的分析带来了巨大的困难。解决这一难题就需要对大批量仪器分析数据进行处理，从中提取化学特征信息，进而实现化学模式识别。已有许多人在指纹图谱解析方面作了大量研究，情况如下： 2．1 相对保留值指纹图谱解析法(GC-FPS) 早在八十年代末期已提出用相对保留值来解析指纹图谱，王智华、洪筱坤在挥发油气相色谱测定中首次提出了用各种色谱峰的相对保留值和其相应的相对峰面积构成各样品的色谱相对保留值指纹图谱，近期再次用于指纹图谱的解析。这种解析方法具有以下特点： (1)将色谱图转换成稳定而易于比较的数据表，实现了图谱的数据化。 (2)由于以相对保留值为色谱峰的峰位，大大减少了各种因素对色谱相对保留值的影响，降低了色谱峰峰位变化的波动性，提高了样品间的可比性。 (3)提高了色谱图中色谱峰的利用率，即可以根据研究需要对各色谱峰进行取舍。 (4)由于实现了数据化，使计算机操作成为可能，也可编成适宜程序形成软件，进而推广应用。 (5)解决了标准品缺乏的问题，即使在没有标准品的情况下也可对中药样品做出可信的鉴定。 为了使色谱指纹图谱更具客观性，研究者还制定了量化标准，如重叠率、N强峰等。王智华等通过对柴胡属19个植物挥发油的气相色谱相对保留值指纹图谱的比较研究，发现不同柴胡属植物有不同的指纹图谱，重叠率和八强峰清楚地显示了它们的差别。王智华等还用HPLC相对保留值指纹图谱对不同属大黄进行了鉴别。 2．2 气相色谱保留指数谱(GC-RI) 常丽萍等用气相色谱保留指数，对挥发油成分进行了定性鉴别。黄远征等在对藁本植物挥发性成分GC-MS研究的同时，按Jennings法测定了各成分保留指数。凌大奎等测定了6种常用中药砂仁、当归、苍术、柴胡、藁本和香附的挥发油成分的气相色谱保留指数，实验测得的GC-RI重现性好，其RSD<1％。研究表明，GC-RI对于鉴别中药是一种有效手段，特别是在中药混乱品种的澄清、指导加工炮制和质量评价方面具有广阔的前景。 2．3模糊聚类分析 聚类分析是近10年来迅速发展起来的一种新的数学方法，是研究事物分类的有效方法，它与判别分析的不同点在于是在没有系统的历史资料的条件下进行的“物以类聚”的分析。随着模糊数学的不断发展，它在医药界的应用也越来越多，已应用于指纹图谱的解析中。符洪等用系统聚类分析对反映黄芩整体化学成分信息的色谱峰面积比值数据进行分析，结果正品黄芩聚为一类，粘毛黄芩、甘肃黄芩、滇黄芩分聚为不同种类。苏薇薇等将聚类分析用于黄 芩分类，准确地区分了药典规定的正品黄芩与非正品黄芩，该法还反映了它们之间化学成份的差异。吴昊将多元统计分析方法应用于参麦注射液HPLC指纹图谱的解析，改进了指纹图谱的解析。然而聚类分析是揭示问题的工具，而不是问题的终结，它的应用必须结合实际的背景。聚类分析应用于指纹图谱，注意力应放在聚类类别数的决策和聚类结果的解释上，具体类别数和聚类结果如何解释要靠深厚的中药知识和认真分析。 2．4分析数据可视化技术 根据科学计算可视化原理，采用灰度映射法建立区间内的数值与灰度间的一一对应关系，以灰度的深浅来连续表征不同数值的大小，从而将数据空间映射到灰度等级空间，实现以图像灰度图来代替抽象数据变化。基于此原理，根据科学计算可视化原理构建中药材质量特征指纹图谱的步骤如下：(1)构建原始信息矩阵；(2)核主成分分析与空间投影变换；(3)采用标准归一化法，使所有数据点变换到[0，1]超立方体内；(4)根据可视化原理对归一化后的数据矩阵中每个行向量(表征一个样品)依次绘制其二维灰度图，最终获取指纹图谱。程翼宇等将色谱数据可视化方法用于辩识34个不同产地及等级的川芎样品，结果令人满意。他们还将分析数据可视化技术用于鉴别3种不同产地当归样品，结果表明它能有效提取红外光谱分析数据的特征指纹，实现了以虚拟指纹图谱对药材产地的分类鉴别。 2．5人工神经网络法(ANN) 人工神经网络法是一门崭新的信息处理方法，已在许多学科中具有广泛应用，这种方法具有分布存储、平行计算、容错和自适应能力，使其在测量数据的特征提取中占重要地位。乔延江等用对称的三层BP人工神经网络方法对22个蟾酥样品9个色谱峰的测量数据进行提取，用提取的两个特征及对应的误差绘图，直接对样本进行分类。苏薇薇等采用反向传播人工神经网络模式识别技术，对78个苦丁茶样品的高效液相色谱数据进行处理，实现了苦丁茶样品的计算机快速鉴别分类。胡步超等运用模式识别，结合人工神经网络对46种紫杉烷的衍生物进行药理肿瘤活性成分的分类。高守国等设计了一种三层的人工神经网络用于特征的提取，用于人工牛黄和天然牛黄的鉴别。 目前在指纹图谱解析这方面的研究很多，以上是应用较多的几种方法，另外还有主成分分析法、相似度法、向量夹角法等。 作为一个能够实际应用于中药质量评价的判断标准，现阶段的指纹图谱在理论和实践上都还需要做大量的工作。在指纹图谱的构建中要注意提取方法应以保留尽量多的指纹特征为前提，还应注意不同检测器对指纹图谱的影响，选择最佳实验条件以保持图谱的完整性、代表性。在指纹图谱的分析上要克服量化指标粗糙的问题，如当对应峰的形状、大小差异较大时，重叠率不能恰当的反映图谱之间的重叠程度。另外对于成分未知的中药，确定其“关键峰”、“非关键峰”、“无意义峰”等技术参数是否合理有待商榷。用计算机来分析指纹图谱所给出的大量信息可以减少人为误差，便于推广，是指纹图谱解析的必由之路。在指纹图谱的 构建与解析中虽有许多问题要解决，指纹图谱还是很有发展前景的中药质控方法，它的深入研究必将推动中药的现代化、国际化，迎来中药发展的新阶段。