中药质量评价与指纹图谱技术

中药质量评价与指纹图谱技术 
 
    常用中药的质量评价一直是中药研究与应用中的难点与重点问题，中药的价值虽然已有上千年实际应用的实践证明，但在现代科学技术飞速发展的今天，如何有效地评价中药的质量，如何保证中药的疗效是一个越来越需要迫切解决的问题。随着中国进入WTO脚步的加快，作为医药界为数不多的具有自主知识产权的中药产品，如何被世界所认同和接受，已经成为医药产业面临的重要课题。如何评价中药的质量才能保证疗效，才能做到与国际水平接轨，才能做到为世界所接受？对此，在基础研究的支持下，应用适当的分析手段建立中药的指纹图谱将是一个有效的手段。在分析这个问题前，我们有必要对中药质量评价的历史与现状做简单的回顾。 
一、中药质量评价的历史与现状

    中药质量评价的历史与中医药的诞生与发展的历史是密不可分的，传说中的“神农尝百草，一日遇七十二毒”，是中医药的起源，也是中药品质评价的开始。古人通过大量的应用实践，观察并总结了中药的治疗作用，同时也发现了这个作用常受到产地，采制方法，炮制方法等不同因素的影响，受到科学技术水平的限制，仅能通过感观的识别，以药材的形态、纹理、气味以及一些简单的理化反应现象，来判断品质的真假优劣，由于评价手段的落后与缺乏有效性，历史上，中药应用中伪劣现象伴随，对医疗事业造成极大的伤害，以致于名医多自种药材于后院，名店则自辟药园，以保证用药的有效与安全。建国以来，随着现代科学手段引入到中药的品质研究中，通过利用植物学、植物化学、分析化学以及药理学等相关学科的研究方法，开辟了中药品质评价的新天地，尤其是自国家“六五”攻关计划中“常用中药的品种整理与质量研究”项目的开展，直至九五期间，已经对200余种常用中药的本草考证、来源、产地、性状、显微特征、理化鉴别方法以及化学成分进行了系统的研究，对这些中药的来源、性状与显微特征等植物学特性有了全面系统的阐述，多数品种进行了化学成分的系统分离，有的还进行了药理试验。这些研究成果，充实了常用中药的品质评价的方法依据，有效地区分了真伪，澄清了品种的混乱现象，为中药的品质研究奠定了坚实的基础，也为中药的真伪优劣鉴别提供了有力的科学依据。在现有研究的基础上，中药的质量研究发展到普遍采用色谱学手段（如薄层色谱，高效液相色谱等），分析中药材或中药制剂中的化学成分，并针对其中的一个或两个成分进行定性或定量分析，无论在药典、部颁标准和地方标准，还是现在申报的新药研究资料中，采用这种方式进行质量的评价已经成为主流，并为中药的发展提供了重要的作用。在一段时间内，这种方法仍将继续推广发展。同时也应该看到，由于多方面条件的限制，在这些研究和应用中，多数中药的化学成分研究缺乏系统性，尤其缺乏与药理作用的结合研究，对明确中药的有效成分或有效部位难以提供可以直接应用的依据。

二、国外植物药的质量评价概况

    国外对中药的认识基本上是基于其来源植物或动物的角度去认识，尤其是植物类中药，所含有的植物化学成分是质量控制的依据，对该类植物药及其制剂的质量评价方法的建立，则是建立于全面的化学及药理学研究的基础之上，如著名的银杏叶标准制剂EGB761的标准，不仅仅控制总黄酮和总内酯的含量，而且对黄酮中槲皮素、山柰酚和异鼠李素的比例，总内酯中银杏内酯A，B，C，J和白果内酯的比例，规定了较为明确的范围。从而全面地反应出制剂的质量内涵。国际植物药市场中出现的标准植物药制剂的概念，就是基于制剂中可控成分的分析结果来体现的，标准人参制剂、标准西洋参制剂，均由国外公司开发成功，其质量标准中的可控成分的种类数量之多，不仅可以全面反应制剂的质量，同时也为消费者提供可靠的质量保证。近年来，国外研究人员已经把目光转移到中药材的质量评价研究上，德国著名的生药学家Wagner教授领导的研究组，先后研究了人参、黄芪等常用中药的质量评价方法，采用TLC和HPLC等手段，利用多种分离到的化学成分作为对照品，进行定性与定量分析，制订出不同来源的药材的TLC和HPLC指纹图谱，为品质评价提供了切实可行的科学依据。美国的民间组织美国草药药典（American Herbal Pharmacopoeia, AHP）也已经开始针对美国市场上流通的热点植物药和中药进行全面的整理，提出行业内可资借鉴的标准，到目前为止已经对贯叶连翘、五味子、甘草等发布了质量标准的单行本，在这些标准中，不仅对这些药用植物的植物特性进行了详尽的阐述，同时也对目前的化学成分的研究结果与质量分析结果进行了评判，并确定了比较稳定可靠的TLC和HPLC分析结果和指纹图谱，为该类药材的生产与应用提供依据。值得注意的是，目前国际植物药市场发展迅速，我国虽拥有传统中医药的优势，但在这个大市场中只是以原料或半成品的出口国的身份参与其中，所占市场分额与收益均不理想，其中重要的原因之一是产品质控技术含量低，不能有效地说明和保证产品质量。

三、中药质量评价的发展对策

    通过对中药质量评价的发展历史与现状的回顾，结合国际植物药品质评价方法的现状，我们不难看出，建立于中药成分的系统研究结果之上的指纹图谱，是现阶段可以全面的反应中药的内在质量的一个有效手段。世界公认，中药化学成分的多样性与复杂性是发挥其疗效的物质基础，同时也是质量评价的重点与难点，在现有研究手段和条件下，由于中医药理论与现代医学的差异，使得阐明中药的有效成分是一项极为困难的研究课题，无论是代表中药现代研究结果的青蒿素，靛玉红，还是人工合成的人工牛黄和麝香酮，均不能代表原有中药的全部功效，而且临床多以复方的形式使用中药，并且讲究随症加减药味，这无疑更增加了分析的难度。相比而言，系统分析中药的化学成分，阐明有效部位或有效成分种类，是可行的。中药药效的发挥，既然不能为一个或一种化学成分所体现，那么，建立全面反应所含成分的指纹图谱，将更加有效地体现中药成分的复杂性，从而更好地评价中药的质量，中药指纹图谱必将成为中药质量评价的发展趋势。

四、中药指纹图谱建立的意义与原则

    中药指纹图谱的建立，其目的是全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。同时指纹图谱也为国际社会所认可，有利于中药及其产品进入国际市场。中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，应体现系统性，特征性，稳定性三个基本原则。系统性，指的是指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位所含大部成分的种类，或指标成分的全部。如中药人参中所含的有效成分多为皂苷类化合物，则其指纹谱应尽可能多地反映其中的皂苷成分；银杏叶的有效成分是黄酮和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法针对这两类成分，分别分析，以达到系统全面的目的。特征性，是指指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种已知的五味子木脂素类成分，而且还有许多未知成分，这些成分之间的顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同，通过这些整体信息，可以很好地区分北五味子与南五味子以及其它来源的五味子药材，判别药材的真伪与优劣。稳定性，指的是所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范围内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。实现指纹图谱的稳定性，除在样品制备方法，分析过程，结果处理等环节规范操作外，还应建立相应的评价机构，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹谱。实现中药指纹图谱的三原则，保证其标准化，做到统一规范，这样才可以使中药指纹谱图得以推广应用。

五、中药指纹谱建立的一般方法和指标

    中药指纹谱的建立方法，应当遵循系统性、稳定性和选择性的三原则。在建立指纹谱的过程中，建立指纹谱的主要过程包括样品的收集、制备方法、分析方法以及结果处理。

1、样品的收集：由于中药来源广泛，所含化学成分的种类及数量常会受到产地、采制等环节的影响，因此，为了确保指纹谱的系统性，必须进行具有广泛代表性的样品收集，尤其是不同产地、不同采收期及加工方式的样品的收集，只有保证了样品的代表性，才能保证建立的指纹图谱的有效性。通过对具有不同代表性的大量样品的分析，可以从中提取出同种药材的稳定的共有信息。目前更多的是收集不同销售地的样品，虽然也能反映一定的信息，但是由于商品流通速度的加快，常常使得样品的分布缺乏代表性，造成指纹信息的偏失。

2、制备方法：通过采用适宜的制备方法，将样品中的化学成分提取、富集，是保证指纹分析的前提。一般的，选用有机溶剂或水提取不同的化学成分，再利用溶剂萃取、柱色谱等手段，使目标成分富集或与其他成分分离，以有利于分析过程的顺利进行。在建立制备方法时，一般要考察提取溶剂、粗分或精制过程，通过比较，选择可以避免干扰，同时又能全面反映成分信息的制备方法，必要时，针对不同种类的成分分别选用不同的制备方法，如黄芪中的黄酮成分和皂苷类成分的制备。

3、分析方法：目前主要采用高效液相色谱方法来建立中药的指纹谱，尤其随着检测器种类的丰富，使得高效液相色谱的使用范围越来越广，以往没有紫外吸收的成分，通过改变不同类型的检测器，可以方便的检出，如ELSD(蒸发光散射检测器)、电化学检测器、以及质谱检测器等，随着通用质量型检测器的发展，高效液相在分析方面越来越趋向于在线化合物的种类识别，在这方面，各种质谱检测器的应用更是得到长足的进步，除了四极杆质谱外，还发展出离子阱质谱，甚至串联质谱，这些成果使得获得的指纹谱信息更加丰富和准确。应用高效液相分析，一般采用等梯度洗脱的方式，随着仪器的可靠性的提高，梯度洗脱方式已经逐步发展起来，使得大量成分的分离在一定时间内成为可能。为了保证结果的可靠性，一般分析时间为1-2小时。

4、结果处理：为了保证结果的准确性，液相色谱的指纹谱中一般要加入内标物或指任出对照品，采用相对保留时间和相对积分面积作为评价指纹谱中色谱峰的参数，通过对大量样品的指纹谱分析，提取出共有峰，并确定这些共有峰与内标物或对照品的相对保留时间和相对积分面积，利用数据处理，得出参数的变动范围。在共有峰的确认过程中，还需要对分析方法和仪器状况进行精密度和重现性考察，以保证结果的稳定。在结果处理过程中，各色谱峰实现良好的分离是保证结果高质量的前提，通过选择适宜的积分参数，保证主要的共有峰参数的良好稳定。实际上，确定共有峰需要综合考察各个色谱峰的情况，一般的，对那些占总峰面积较大的色谱峰应当优先考察，这些峰往往可以代表样品的信息，对那些稳定的小峰则应当根据分离情况对待。中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，一般差值不宜大于±20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不应大于±25％；单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值无需要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。各个样品指纹谱中的非共有峰应当越少越好，由于中药的复杂性，非共有峰常常较多，一般的，非共有峰的峰面积不应超过总峰面积的10%。

　

六、中药指纹谱建立所面临的问题与对策

    中药指纹谱图的建立，在技术上是完全可行的，但是在实际应用中，还面临许多问题，如中药来源品种的混乱、无序；产地、采制、加工方法的差异；基础研究的片面化，低水平重复等现象的存在，严重制约中药指纹图谱的建立与推行，只有加强中药种植与加工的规范化，中药化学成分研究的系统化与标准化，中药药理研究的规范化等中药生产、流通和研究领域的标准化进程，才能保证中药质量的稳定，也才能保证中药指纹图谱建立的可行。技术上实现中药指纹图谱的建立，还需要结合现代分析技术手段。针对中药指纹图谱的研究，所涉及的方法种类繁多，包括TLC，TLCS，HPLC，HPLC/MS，GC，GC/MS，HPCE，IR, NMR以及X-射线衍射等，其中，色谱学方法是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色谱技术，已经为大家所公认的三种常规的分析手段，随着科学技术的发展，色谱分析仪器的完善与提高，使得无论是薄层色谱还是高效液相色谱，在克服自身固有的缺陷，发挥自身优势方面有了长足的发展，成为三种互相补充，相互结合的分析手段，其中HPLC方法随着新的高效通用型检测器的发展，如ELSD，ESIMS，MS/MS等设备的引入，使得HPLC的适用性与灵敏度得到显著提高，从而使复杂样品的成功分析成为可能。这些新设备新技术的应用，将使中药及其制剂指纹图谱的建立更加有效。

结 语

    实现中药的现代化已经成为国家的重要目标，加强中药品质评价的现代化与标准化是其中的重要内容，指纹谱图将是完成这一内容过程中的重要关键技术。中药指纹图谱的建立，不是一个或几个实验室就可以完成的研究课题，需要中药生产、流通、临床及研究等领域的广泛参与，只有协同合作，才可以保证中药指纹图谱具有系统、特征及稳定的特性，同时也将保证中药指纹图谱的广泛性与实用性，一个规范标准的指纹图谱将会有力地推动中药的现代化进程。