RAPD操作要点

　　　　一、材料

　　　　不同来源的DNA(50ng/ul)。

　　二、设备

　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。

　　三、试剂

　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。

　　2、Taq酶：购买成品。

　　3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。

　　4、MgCl2 ：25mmol/L。

　　5、dNTP：每种2.5mmol/L。

　　四、操作步骤：

　　1. 在25ul反应体系中,加入

　　模板DNA 1ul (50ng)

　　随机引物 1ul (约5pmol)

　　10xPCR Buffer 2.5ul

　　MgCl2 2ul

　　dNTP 2ul

　　Taq酶 1单位（U）

　　加ddH2O 至 25ul

　　混匀稍离心, 加一滴矿物油。

　　2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环： 94℃ 1分钟，36℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共40轮循环。

　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。

　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐，分辨率高）。

　　5. 电泳结束，观察、拍照。

　　[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。

　　　　2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。