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与日益增长的序列信息相结合的实验基因组学有望能够改变研究细胞和细胞相互作用的方式.高丰度的DNA阵列能以平行和定量的方式研究RNA 和 DNA 的复杂的混合物,在实验方面可以与基因组的序列信息相结合. DNA 阵列能被用于许多不同的目的,其中最显著的是能同时测量数万个基因的表达水平. DNA 阵列对于基因表达水平的测定及其他应用使得基因组中所包含的许多信息具体化.
生物学和生物医学的研究正处于一个显著转变时期,而这个转变是由两个主要因素驱动： DNA 序列信息的大量增长以及为利用这些信息的技术的发展。在过去的几年中,有30多个机体的全基因组序列已被测定,还有另外100个左右正在测定.目前至少已获得了数万个小鼠,大鼠,人的基因的部分序列,并且人的两条染色体(染色体 21 和 22)的全序列测定也已完成.在公众和私人的努力下,人类染色体的大部分序列将在一年内被译解,无疑小鼠及其它动植物的全序列测定也会尽快完成.不幸的是,数十亿个碱基的DNA序列并不能告诉我们所有的基因起什么作用.细胞如何工作和如何形成有机体,机体生病时是什么地方出了毛病,我们是怎么逐步走向衰老的以及符合来开发新药.这些正是功能基因组将要发挥作用的舞台.基因组的目的是理解生物学,而并不只是简单的确定物种的组成部分,实验及计算机的方法等应尽可能的利用尽可能多的数据.在这个意义上,与其称功能基因组是特定的项目或工程,到不如称它为解决问题的一般方法.功能基因组的目的决不仅仅是提供一个关于所有的基因和信息的功能的目录,而是去理解这些基因如何协调工作来形成有功能的细胞和有机体.
为了充分利用巨大的快速增长的序列信息,我们需要新的技术.研究基因组的最强有力且最有用的工具是高密度的寡核苷酸或互补DNAs阵列.核酸阵列的工作原理是用溶液中标记好的RNA或DNA分子和固定在阵列表面特定位点的DNA杂交.样本和阵列的杂交实际上是每个分子寻找其在"亲和介质"上匹配分子的高度平行搜索过程,表面上最终匹配的分子是由分子识别规则决定的.传统的阵列是由分散在多孔膜上的未知序列的DNA片断组成.阵列化的DNA片段常常来源于cDNA,基因组DNA或质粒文库,而杂交的探针常常是用同位素标记的.近来,随着能以非常高的密度合成或把核苷酸点在玻璃表面上的新技术的发展及荧光检测技术的新发展,核酸阵列逐渐小型化,这就提高了实验效率增加了信息容量.
与过去仅能制作几百个元素的阵列相比,近来以生产出了每平方厘米有250,000个不同的寡核苷酸探针或10,000个不同的cDNAs的阵列.尽管现在能够合成或堆积未知序列的DNA片段,但最常用的方法是设计基于特异序列的阵列,这个方法有时被成为"把基因组下载到芯片上".然而,这个方法的基本技术主题也出现了若干变化：杂交反应可以被控制(例如,通过电场);除了荧光外也可以用其他检测方法;除了玻璃外,其他材料如塑料,硅,黄金,凝胶或膜甚至光学纤维的末端都可以作为阵列的表面材料.我们这篇评论的焦点就是集中于玻璃上的高密度核酸阵列以及他们的生物学应用,核酸阵列也常常被称为微阵列,寡核苷酸阵列,基因芯片阵列,或只是简单的芯片).
整体的基因表达实验
迄今为止DNA阵列最重要的一个用途是检测基因的表达.从基因组DNA转录的基因总和,有时也成为表达谱或转录组,是研究细胞表型和功能的一个重要决定因素.从基因组DNA转录出mRNA是蛋白合成的第一步,细胞所处环境改变或受到侵犯时其形态和生理状况都会发生改变,而这些都是由于基因表达的不同引起的.和基因组水平不同,转录组是高度动态的,当细胞受到侵犯时,甚至当细胞处于正常的生理活动如复制,分裂时,基因的转录情况也会变化很大.为了了解基因的功能,知道基因何时何地以及何种程度的表达对于理解基因编码的蛋白质的活动和生理作用是至关重要的.另外,多基因型的改变也可为了解细胞的调节机制,更广泛的细胞功能及生化代谢途经提供线索.在对人类健康和治疗的研究中,从这些转录组水平获得的知识可有助于人们了解疾病的前因后果,了解药物及候选药物如何在细胞和组织间工作以及基因产物如何发挥治疗效果.
过去对于阵列的讨论常常集中于技术方面,现在已构建了不同组织的核酸阵列,并且在不同的实验中也已成功的检测了基因转录丰度,人们对阵列研究所感兴趣的重点已经转移了.现在研究者们多集中于考虑有关实验设计,数据分析,从有限组织所获得的少量mRNA的应用等有关问题,以及如何用最好的方法从实验结果,路经及细胞环路模型中了解其生物意义,并且人们还非常关心表达谱的医学应用.
基于阵列的基因表达监测
用阵列来衡量mRNA 表达丰度的方法是衡量mRNA 表达情况的常规的方法的一个更有力的代用品。在早期的一些试验当中,只有那些被认为是比较重要的小部分基因才用阵列方法进行检测.然而,这样的试验并没有发挥阵列的潜能： 使用数组的一个关键的优点是它能同时检测数万个基因的表达而不需要预先猜测重要基因的作用机制.因此,我们并不需要仅仅在谚语的街灯柱下面观看细胞的的反应,而应该对此获得一个更宽广，更完全并且少些偏导的看法.
基于阵列观察的大容量几乎可以确保使观察者获得令人惊奇的结果.近来的一个研究测量了人的正常细胞分裂周期中大约40000个基因的转录变化.除了那些诱导DNA复制,参与细胞周期调控以及染色体分离的基因被预料在细胞周期的特定阶段表达外,另外参与平滑肌运动,衰老,胞间粘附及细胞运动性的基因也被发现在细胞周期的特定阶段表达发生改变.所获得的结果可以有效地证明当在更大范围的基因空间进行系统搜索时能获得大量的新信息.除此之外,由于阵列常常用一些未知功能的基因作探针,或是部分的序列信息,因此,可以想象这样获得的结果会是新奇的和令人吃惊的.
其他一些基因表达检测方法
无疑,还有其他一些方法来检测mRNA丰度, 基因表达及表达的变化.对于在mRNA水平上测量基因的表达, northern杂交, RT-PCR,核酶保护, cDNA测序,克隆杂交,差异显示,减法杂交, cDNA片断指纹图谱, SAGE等方法都已经在测量特异基因的表达,获得大范围的基因表达谱,及了解mRNA丰度的显著变化上得到了很好的应用.但是如果mRNA仅仅是产生有功能的蛋白的中间产物,为什么要测量mRNA呢? 很简单地一个原因是基于蛋白质的途径通常更困难,敏感性较差.但更重要的一个原因是由于mRNA水平包含了细胞状态及基因活动的广泛信息,并且对于某些基因而言, mRNA丰度的变化与蛋白丰度的变化紧密相关.尽管mRNA非常重要,还是有许多方法被发展起来直接或间接的检测蛋白水平的变化.这些方法包括western杂交,2维凝焦电泳,层析法,质谱检测,特异的报告融合蛋白构建,比色法,多核糖体mRNA等.
基于蛋白的监测方法的重要性在于他们测量的是最终的表达产物而不是中间产物.另外,他们中的一些方法能检测蛋白的翻译后修饰(如磷酸化和糖基化)和蛋白复合体的形成,蛋白的位置及产量信息,而这些信息直接测量mRNA是得不到的.因此,基于蛋白和基于mRNA的方法是互补的,两者各有千秋.
人类的疾病,基因的表达及发现
基因组和基因表达实验有时被人们嘲弄地称为"钓鱼探险".我们的看法是如果你紧跟的是一条鱼,那么钓鱼探险也不是错误的,这就好比参与代谢的新基因,可能的药物靶分子或表达标记都可被用于预测和诊断疾病.由于阵列可以在仅了解部分序列信息的情况下来应用,因测它可以用来研究一些完全未知的基因.在许多方面,与传统的遗传学任意构建突变,再筛选和发现有兴趣的遗传型相比,阵列的方法更敏感更容易了解特异的基因.
如此广泛的发现实验被称为问题驱动而不是传统意义上的假设驱动的实验方法更为恰当,但这些并不能降低他们理解基本生物过程甚至是理解和治疗人类疾病的价值.例如,在分析从正常和患急性白血病或扩散的大B-cell淋巴瘤的个体中取得的大量样本时,基因表达(mRNA)标记可被用来分类鉴别这些癌症.在这些研究中,检测大量基因表达的重要性被阐述的非常清楚. Golub et al发现了可靠的预言不能基于任何单个的基因来做,但是基于50个基因的表达水平(从6,000多个在数组上检测的基因)的预测确是高度精确的。这些实验结果表明当确定临床病症的表达标记时需要测量较多的个体和较多的基因.但是有限的原始数据也有可能帮助鉴别不寻常的病症并且运用这些信息来指导病人的临床治疗.
也有可能运用相关的途经来帮助人们理解生癌的,变形的细胞的问题所在,并确定这些疾病的相应基因.治病的原因和潜在的治疗目标可以通过检测基因在不同的肿瘤类型中的表达来鉴定,研究者会用生长因子处理细胞或细胞株而有目的的使有些特异的候选基因过量表达从而来确定下游的靶基因或研究某些信号途经.肿瘤的生成常常伴随有染色体DNA的变化,例如遗传重排,扩增或特定遗传位点的丢失,发育的异常. Down's 和 Turner's综合症的发生,就是由于DNA拷贝数的异常引起的.因为基因组DNA在许多方面与mRNA一致,比较基因组区域的拷贝数目或遗传标记的基因型可以用来检测癌细胞或前癌细胞中扩增或缺失的染色体区域和相关基因.研究者们用含有大量基因和多形态标记的探针的阵列方法已成功地检测出胸腺癌细胞和肿瘤中DNA拷贝数的变化.确定基因组中拷贝数的变化和染色体重排何时何地发生可以用来鉴别癌细胞的类型以及抑癌基因所在区域.
有关整个基因组的假设
当然,利用基因组有关的工具,比如阵列法,并不排除假设驱动的研究.对于完全测序的机体,包含有基因组中每个注释的基因为探针的阵列已经产生.利用这些结果,人们可以了解一个转录因子在转录中是发挥全局作用(影响所有的基因)还是特定的作用(仅影响几个基因)呢? Holstege et al在研究酵母的基因组范围的表达分析时用这种方法仔细地了解了转录起始机制.相似的,酵母中位于染色体末端的区域(像配型位点的基因一样)的基因被认为是转录"沉默"的.全基因组的阵列研究能确定出染色体转录沉默区,鉴别出少数已经得到仔细研究的端粒区基因行为是否与所有端粒基因行为相符,并能了解近着丝点的基因是否也是转录沉默的.
值得强调的是这些新的,平行的研究方法并不能替代传统的研究方法.像northern 杂交,western杂交, RT-PCR这些标准的方法多被用在目的更明确的实验中,从而来互补用阵列研究得到的大范围的基因表达,代谢途经,作用机理的研究结果.由于假阳性发生的概率非常低,因此没有必要证实结果中的每个变化是否真实可信,尤其结论是基于多个基因的变化而不是仅由单个基因得出的.但是,如果仅仅选出单个基因来作为药物研究的靶分子或是其他用途,那么一些细致的下游实验还是非常有必要继续进行的.