酶标对流免疫电泳

（一）原理 利用酶标记抗原（抗体）和待测抗体（抗原）在电场中向一定方向移动，在比例适当的地方形成沉淀线，通过酶作用底物而显色，指示沉淀线的存在。该法的敏感性大大高于对流免疫电泳。 本试验以检测血吸虫抗体为例。 （二）材料与试剂 1．0.02Mol/pH 8.6巴比妥缓冲液 巴比妥   0.553g 巴比妥钠    3.503g 乳酸钙   0.512g H₂O   加至   1 000ml 2．0.1Mol/L pH7.0PBS（0.14Mol/L Nacl） 3．0.2Mol/L pH7.6硼酸缓冲液 硼酸    10.510g 硼砂      2.860g H₂O   加至   1000ml （三）操作方法 1．酶标抗原的制备 用1ml血吸虫卵抗原（蛋白含量为1.5mg/ml~2.0mg/ml）加入3mg~4mg辣根过氧化物酶（蛋白质：酶=1︰2），液体呈棕红色，然后在轻轻搅拌下，缓慢加入50μl 1％戊二醛，要求在5min~10min内滴加完毕。置20℃~25℃搅拌2h。装入透析袋，于1000ml、0.1Mol/L pH7.0PBS液4℃透析2天，并换液3次~4次。取出酶标记物加等量纯甘油，使含50％甘油试剂，即为酶标抗原。分装小瓶，存于-20℃中备用。 2．琼脂凝胶板的制备 取优质琼脂，以0.02Mol/L pH8.6巴比妥缓冲液制成1％琼脂，溶化后，置于玻片上，制成2mm厚的凝胶板。 3．打孔加样 打6对孔，抗原孔径为0.30cm，抗体孔为长方形0.2cm×1.1cm。抗原、抗体各加5μl及50μl。抗原用上述酶标抗原做1︰20至1︰30稀释。 4．电泳 抗原孔置于负极，电压4 V/cm ~5V/cm，电泳时间45min~60min，电泳后，于蒸馏水中荡洗1min~2min即可，用滤纸吸去水分，并用毛细吸管吸尽长孔及圆孔中的水液后，即可用底物的溶液显色。 5．配制底物溶液，现用现配。将饱和联苯胺溶液，加等量pH7.6硼酸缓冲液，然后将上液9份和0.1％过氧化氢1份相混，即为所需的底物溶液。 6．免疫酶染色 将琼脂凝胶板置于培养皿中，缓缓倾入底物溶液，直至浸没凝胶板为止，置于室温或37℃，经1h~2h用目测可观察反应结果。 （四）结果判定 1．阳性反应：在抗原抗体孔之间呈现明显的棕红色的线条。 2．阴性反应：不出现棕红色线条者。