IL-1、TNF在局部脑缺血/再灌注中的表达

IL-1、TNF在局部脑缺血/再灌注中的表达

中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第1期第6卷 论　　著

作者：李岚　屠永华　赵光东

单位：李岚　赵光东　解放军医学高等专科学校内科教研室，大连116017；屠永华　重庆第三军医大学附属一院

　　关键词: 脑缺血/再灌流；白细胞介素1；肿瘤坏死因子

　　摘要　目的　研究脑缺血/再灌流损伤中IL-1、TNF的来源、变化规律和作用。方法　用免疫组化方法检测了局部脑缺血/再灌流大鼠模型中IL-1β、TNF-α的表达。结果　缺血组(I)3 h I L-1β表达增多并持续至120 h，缺血再灌流组(IR)0.5 h IL-1β即明显增高，高峰在24 h,120 h已降至对照组(C)水平，阳性细胞主要为纹状体区及顶叶皮层的神经元、胶质细胞和血管内皮细胞；I组和IR组0.5 h TNF-α表达增多，12 h达高峰，持续至120 h，阳性细胞为纹状体和缺血皮层的神经元和胶质细胞。结论　IL-1β、TNF-α参与缺血/再灌流脑损伤，其来源于损伤局部的神经元、胶质细胞及血管内皮细胞，并对其作用进行了探讨。

　　中图号　R743.9

The Expression of IL-1 and TNF in the Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion of Rats

Li　Lan　　Tu Yonghua　　Zhao　Guangdong

　　(PLA Dalian Junior College of Medical Science,Dalian 116017)

　　Objective　A study on the functions and the change of sources of IL-l and TNF in the lesion of cerebral ischemia/reperfusion.Methods　The examination of the IL-1 and TNF expressions in the rat model of the focal cerebral ischemia/reperfusion with immunohistochemical methods.Results　The IL-1β expression in ischemia group(I) is significantly increased in 3 h and lasts for 120 h,while IL-1β in ischemia/reperfusion group(IR)is significantly increased in 0.5 h with its peak appearing in 24 h and falling to the level of the control group(C)in 120 h.The positive cells are mainly the neurons of striate body and pariete lobe of cortex,gliocytes and vascular endotheliocytes. The expression of TNF-α in group I and IR is increased in 0.5 h with its peak appearing in 12 h and continuing until 120 h.The positive cells are the neurons of striate body and ischemic cortex and gliocytes.Conclusion　IL-1β and TNF-α，which come from the neurons,gliocytes and vascular endotheliocytes at the location of lesion,are involved in the lesion of cerebral ischemia/reperfusion.

　　Key words　cerebral ischemia/reperfusion;interleukin-1;tumor necrosin factor

　　白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)是多功能细胞因子，参与机体免疫反应和应激反应，对炎症的调节和血管内皮损伤亦起重要作用。文献报道缺血脑组织中IL-1、TNF增多，但其来源目前尚不十分清楚^［1～3］。本研究通过观察大鼠局部脑缺血/再灌流模型中IL-1β、TNF-α在不同时相点的表达，旨在探讨其变化规律及其在缺血性脑损伤中的来源和作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　试剂：山羊抗大鼠IL-1β单克隆抗体由美国R and D公司提供 ，小鼠抗人TNF-α单克隆抗体由军事医学科学院提供，SP试剂盒为福州迈新公司产品，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.1.2　实验动物：健康Wistar大鼠，雌雄各半，3月龄，体重250～300 g，由第三军医大学实验动物中心提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物分组：动物随机分为缺血组(I)、缺血再灌流组(IR)和对照组(C)，每组分别设0.5、3、12、24、120 h等5个时相点，每个时相点3只动物。

　　1.2.2　大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型的建立：参照 Longa和Kuga^［4，5］报道的方法，即用颈外动脉插入线栓法，脑缺血后0.5 h拔除线栓即造成MCA缺血再灌流模型，C组动物接受手术，但不插入线栓。

　　1.2.3　IL-1β、TNF-α的检测：在实验规定时间各取1只动物用40 g/L多聚甲醛经心脏灌注固定，取脑置于40 g/L多聚甲醛中后固定24 h，移入200 g/L蔗糖中12～24 h脱水，用恒低温冰冻切片机作冠状切片，片厚25 μm，用免疫组化SP法进行染色，阴性对照用PBS替代第一抗体。

　　1.2.4　阳性评定及分析：在光镜下细胞膜、细胞浆呈棕色为IL-1β、TNF-α免疫组化阳性。用德国LEICA公司MD20型真彩色图像仪进行图像分析，结果用光密度x±s表示。统计学处理用SPZM软件进行方差分析。

　　2　结果

　　2.1　IL-1β的表达　C组有少量IL-1β表达，各时相点之间无差异；I组3 h时IL-1β表达增多，与C组比较差异显著(P＜0.05)，24 h达高峰且与C组比较差异非常显著(P＜0.01)，120 h时仍维持较高水平；IR组0.5 h时IL-1β表达即明显增多，高峰亦在24 h，高峰值明显高于I组(P＜0.05)，而IR组120 h已降至C组水平(表1)。I组3 h及IR组0.5 h阳性细胞主要在纹状体区，12～24 h除纹状体区外亦可见于顶叶皮层，棕色的阳性反应主要在神经元的胞浆和突起，细胞核不染色，I组和IR 组24 h还可见阳性反应的胶质细胞及条索状血管结构。

表1　IL-1β免疫组化染色光密度

　　Table 1　IL-1β optical density of immunohistochemical staining (n=3,

Group	t/h
	0.5	3	12	24	120
C	330±66	450±102	431±97	398±161	489±104
I	426±108	894±223*	1101±215**	2003±276**#	823±103*
IR	751±171*	1043±103**	1299±190**	2682±194**	441±77

　　*P＜0.05, **P＜0.01 compared with C group; # P＜0.05 compared with IR group2.2　TNF-α的表达　C组有少量TNF-α表达，I组和IR组0.5 h时TNF-α表达迅速增多，与C组比较差异非常显著(P＜0.01)，两组均在12 h时达高峰，持续升高至120 h(表2)。I组和IR组0.5 h时纹状体区及缺血皮层可见阳性染色的神经元，12～24 h明显增多，I组12 h、IR组24 h时可见阳性胶质细胞，120 h时神经元表达减少，但仍有较多的阳性胶质细胞，但无阳性染色的血管结构。

表2　TNF-α免疫组化染色光密度

　　Table 2　TNF-α optical density of immunohistochemical staining (n=3,

Group	t/h
	0.5	3	12	24	120
C	66±28	69±32	79±33	81±24	76±40
I	350±67**	934±134*	2038±685**	1101±222**	1458±566*
IR	392±113**	854±435*	1511±591*	1189±488*	1440±584*

　　*P＜0.05, **P＜0.01 compared with C group

　　3　讨论

　　近年来研究表明，在脑缺血的病理过程中有免疫应答参与，其中细胞因子水平的变化正受到广泛关注。我们的研究发现，I组0.5 h时脑内IL-1β含量无明显改变，3 h起增高并持续至120 h，与国外报道结果类似^［1］。还观察了IR组IL-1β的变化显示，其表达明显提前，峰值更高，但持续时间较短。

　　Liu等^［3］报道经颅完全性大脑中动脉阻塞的WKY大鼠缺血皮层3 h TNF-α mRNA开始增高，高峰在12 h，一直持续至5 d,我们研究结果显示TNF-α表达较其提前，高峰时间与其一致，并显示I组及IR组TNF-α均持续升高至5 d,提示脑缺血/再灌流损伤时脑内IL-1β和TNF-α合成机制被激活，导致其大量表达。高浓度的IL-1β和TNF-α在脑缺血中的作用可能通过以下途径：(1)介导粘附分子(ICAM)表达增多，引起血管炎性反应。(2)IL-1β可使磷酯酶A₂增多，膜磷脂过度降解，直接引起细胞膜损伤。(3)使血液中TXA₂活性增加、血管舒张因子下降和ET增加而导致血管收缩，加重脑缺血。(4)TNF既能诱导内皮细胞产生凝血活性，引发PAF、TXA增加，又可抑制内皮细胞抗凝血蛋白C旁路辅助因子的活性，使内皮细胞表面形成促凝状态，加重血栓形成。(5)TNF-α、IL-1β可使脑局部产生兴奋性氨基酸增多，并可作用于多种炎性细胞诱导一氧化氮合成酶激活，NO合成增加，从而加重对神经系统的毒性作用^{［2，6～8］}。

　　文献报道，脑缺血早期IL-1β和TNF-α mRNA 明显增多，早于周围免疫细胞的反应，推测其可能来源于损伤的神经元、星形细胞和小胶质细胞^［3］。本研究证实缺血早期IL-1β、TNF-α主要在纹状体区表达，缺血再灌流12 h起在纹状体和缺血皮层表达，提示上述脑区对缺血较敏感。IL-1β、TNF-α阳性细胞为神经元、胶质细胞和血管内皮细胞，证明脑内上述细胞是IL-1β、TNF-α合成和分泌的部位。

　　最近Yamasaki等^［9，10］报道,给脑缺血大鼠脑内注射外源性IL-1β中和抗体或IL-1β阻滞剂原卟啉锌(ZnPP)阻断IL-1β对缺血脑区神经细胞的损伤，可减轻脑水肿程度，缩小梗死范围，减少梗死区白细胞浸润，提示对抗其毒性作用可减轻脑缺血/再灌流损伤。Hara等^{［11，12］}证明抑制IL-1β转换酶(ICE)能通过干扰IL-1β合成和/或抑制缺血神经元凋亡减轻缺血性脑损伤。Dawson^［13］也提出阻断TNF-α作用可能对脑缺血有益。本研究证明，IL-1β和TNF-α在局部脑缺血/再灌流时表达增多，且因病变时间差别而使表达水平和表达细胞不同。进一步研究脑内多种细胞在不同时间表达的IL-1和TNF在缺血性脑损伤中的作用机制，可望为临床脑缺血治疗提供一新途径。

　　参考文献

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　　11　Hara H,Friedlander RM,Gagliardini V,et al. Inhibition of interleukin 1 bata converting enzyme family proteases reduces ischemic and excitotoxic neuronol damage. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(5):2007-2012

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　　13　Dawson DA,Martion D,Hallenbeck JM. Inhibition of tumor necrosis factor-α reduces focal cerebral ischemic injury in spontaneously hyertensive rat.Neurosci Letters,1996,218(1):41-44

(1998-03-13收稿)