点击显示 收起
多发性硬化外周血单个核细胞 IL-2及TGF-β mRNA表达研究
中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第4期第6卷 论 著
作者：林艾羽 慕容慎行 林嘉友 许国英
单位：福建医科大学附属第一医院， 福州 350004
关键词: 多发性硬化；细胞因子；白介素-2；转化生长因子-β
摘要 目的 观察多发性硬化 (MS) 患者外周血单个核细胞 IL-2 及TGF-β mRNA 的表达。方法 采用逆转录 PCR 方法检测 24 例 MS 患者及 15 名对照组外周血单个核细胞白介素-2 (IL-2) 及转化生长因子 (TGF-β) mRNA 表达， 其中 MS 组患者活动期 15 例， 稳定期 9例。结果 活动期 MS 较稳定期和对照组 IL-2 mRNA 表达显著增高 (P＜0.01)， 而 TGF-β 表达明显降低 (P＜0.01)。 稳定期患者的 IL-2 mRNA 表达明显降低， TGF-β 表达明显增高， 与活动期各相应指标对比， 其差异也有显著性意义 (P＜0.01)。结论 提示这些细胞因子参与 MS 自身免疫的过程。
中图号 R 744.5+1
The mRNA Expression of IL-2 and TGF-β in Peripheral
Blood Mononuclear Cells of Multiple Sclerosis
Lin Aiyu Murong Shenxing Lin Jiayou Xu Guoying
(Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350004)
Objective To observe the mRNA expression of interleukine-2 (IL-2) and transforming growth factor-β (TGF-β) in peripheral blood mononuclear cells of Multiple Sclerosis. Methods The IL-2 and TGF-β mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells of 24 cases of MS (15 cases are active MS, 9 cases are stable MS) and 15 normal controls were detected using RT-PCR technique. Results The data showed that active phase of MS had a higher mRNA expression of IL-2 than stable phase of MS (P＜0.01) and controls (P＜0.01); and a lower expression of TGF-β than stable phase and controls (P＜0.01). During stable phase of MS, the expression of IL-2 was significantly decreased (P＜0.01) while TGF-β was significantly elevated (P＜0.01). Conclusion The result showed cytokine had included in the process of the autoimmune disease.
Key words multiple sclerosis； cytokine； interleukine-2； transforming growth factor-β
多发性硬化 (MS) 是神经系统自身免疫性疾病， 存在体液免疫和细胞免疫异常。 活化的免疫细胞能产生相关的细胞因子， 它是一种可介导和调节免疫、 炎症反应的小分子多肽， 具有高效性、 多样性及网络性等特点， 以协调调节机体正常生理活动。 本研究对 24 例 MS 患者及 15 名正常者进行外周血单个核细胞白介素-2 (IL-2) 和转化生长因子-β (TGF-β) 检测， 以阐明其免疫发病机制， 并探讨其临床意义。
1 材料和方法
1.1 研究对象
1.1.1 MS 患者组： 本组 24 例均为我科门诊或住院确诊的病例， 均符合 1983 年 Poser 提出的 MS 的诊断标准［1］。 其中男 11 例和女 13 例， 年龄 22～54 岁， 平均 46.4 岁。
1.1.2 对照组： 健康献血员及本院健康职工 15 例， 其中男 8 例和女 7 例， 年龄 25～40 岁 (平均年龄 30.1 岁)。
1.2 实验方法
1.2.1 单个核细胞的获得： EDTA 抗凝的外周血， 用枸橼酸 PBS 稀释 1 倍， 用淋巴细胞分离液离心， 小心吸取中间细胞层。 加入 RPMI-1640 培养基， 予 PHA 10 μg/mL 激活， 置 37℃、 5% (体积分数) CO2 培养箱孵育 4 h 以激活单个核细胞。
1.2.2 总 RNA 的获得： 采用酚-氯仿抽提法提取。
1.2.3 cDNA 的获得： 通过逆转录反应将总 RNA 变为 cDNA。
1.2.4 PCR： 将已获得的 cDNA 作为模板， 加入不同的引物 (表1) 进行 PCR 扩增， 条件为：
IL-2： 95℃ 3 min 变性， 94℃ 40 s， 54℃ 40 s， 72℃ 1 min 35 圈， 最后 72℃ 延伸 10 min；
TGF-β： 95℃ 3 min 变性， 94℃ 40 s， 58℃ 40 s， 72℃ 1 min 35 圈， 最后 72℃ 延伸 10 min。
表1 PCR 引物序列
Table 1 Sequence of PCR primer
| cDNA | Product (bp) | Primer 1 | Primer 2 |
| β-actin | 320 | 3′GCATGGAGTCCTGTGGCAT5′ | 5′GGTGGCGTTTACGAAGATC3′ |
| IL-2 | 265 | 3′ACTCACCAGGATGCTCACAT5′ | 5′AGGTAATCCATCTGTTCAGA3′ |
| TGF-β | 379 | 3′TCGCCCTGTACAACAGCAC5′ | 5′CTCCGGTGACATCAAAAGAT3′ |
1.2.5 其它： 各基因片段的 PCR 产物经 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳证实 (附图)， 其条带的强弱经凝胶图像分析， 所测得的密度分别与内参照相比较， 取其比值作为相对数值并进行统计学分析。
附图 在 15 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测各 PCR 产物
fig Detection of PCR products on 1.5 g/L agrose
1： PBR322/Hinf Ⅰ marker；
2： PCR product of β-actin；
3： PCR product of IL-2；
4： PCR product of TGF-β
1.2.6 统计学方法： 各组数据以均数和方差表达， 用 t 检验进行各组数据差异的显著性意义分析。
2 结果
(1) MS 组的 IL-2 mRNA 水平较对照组增高， 而 TGF-β 较正常组降低， 差别均有显著性意义 (P＜0.01) (表2)。
表2 MS 患者 IL-2 及 TGF-β mRNA
表达的水平与对照组比较
Table 2 The mRNA expression of IL-2
and TGF-β of MS patients were
compared with normal controls
| IL-2 | TGF-β | |
| MS | 1.21±0.82* | 0.76±0.54* |
| Controls | 0.30±0.26 | 0.66±0.35 |
*P＜0.01 compared with controls
(2) MS 活动期患者 IL-2 的 mRNA 表达较对照组增高， 差异有显著性意义 (P＜0.01)， 而 TGF-β 降低亦有显著差异 (P＜0.01)。 稳定期患者 IL-2 表达明显降低， 而 TGF-β 明显增高， 与活动期各相应指标对比， 差异有显著性统计学意义 (P 均 ＜0.01) (表3)。
表3 MS 患者活动期与稳定期 IL-2 及
TGF-β mRNA 表达水平的比较
Table 3 The mRNA expression of IL-2and TGF-β of active MS
compared with stable MS
| IL-2 | TGF-β | |
| Active MS | 1.46±0.92* | 0.45±0.23* |
| Stable MS | 0.69±0.34* | 1.29±0.55* |
*P＜0.01 compared with stable MS
3 讨论
关于细胞免疫异常在 MS 中所占的主要地位已被人们所认识， 特别是细胞因子在该病中所起的重要作用也已得到公认［2～4］。 细胞因子由淋巴细胞、 单核巨噬细胞、 成纤维细胞等多种细胞产生， 是一种与免疫反应密切相关的小分子多肽类糖蛋白质， 是连结细胞免疫和体液免疫的“桥梁”， 通过与相应受体结合， 将信号传递到靶细胞内部而起作用［5］。 细胞因子在机体内部构成统一网络， 相互协调、 相互拮抗， 从而调节着机体的生理活动。 本研究选取 IL-2 及 TGF-β 作为主要指标， 目的在于了解不同细胞因子在 MS 病理机制中的作用， 进一步阐明 MS 的自身免疫性疾病的发病机制。
本研究结果表明， 活动期患者 IL-2 的表达增高， TGF-β 的表达降低， 该期起主导作用的应是 IL-2 的增高表达。 因为该因子增高后带来了许多不良的作用， 包括： (1) 促进了活化的 T 细胞和 B 细胞的生长； (2) 能诱导 Th 细胞的增殖； (3) 提高活化的 B 细胞合成免疫球蛋白［6］。 通过以上三个方面可进一步促进免疫的炎性反应及病理损伤过程， 提示该因子作为一种免疫炎性细胞因子对于整个免疫过程的发展占有很重要的地位。 一般而言， TGF-β 在此期尚处于低水平的表达， 故无法起着保护作用， 因此往往表现出明显的神经系统功能损害， 临床症状加重。 稳定期 IL-2 表达下降， 而 TGF-β 则出现了高表达， 此期起主要作用的是高表达的 TGF-β。 TGF-β 主要通过以下几方面来发挥其免疫抑制作用：(1) 它可抑制免疫活性细胞的增殖；(2) 能抑制巨噬细胞；(3) 可拮抗炎性细胞因子， 从而抑制细胞免疫应答对靶器官的损伤；(4) 同时也能抑制体液免疫。 由于该因子对机体的保护作用［7］ 临床表现为病情相对稳定。
近年来对 TGF-β 这类细胞因子的研究进一步深入。 通过实验性变态反应性脑炎 (EAE) 的动物模型观察到， 去 TGF-β 基因的大鼠可产生慢性器官炎症［8］， 利用抗体阻断 TGF-β 作用后能使 EAE 加重［9］。 实验还证明了 TGF-β 能通过抑制 TNF-α 和 TNF-β 等的产生而改善 EAE 病情［10］， EAE 动物的 TGF-β mRNA 表达缺乏与病情慢性化有关［11］。 从该因子的缺乏所造成的病情恶化的种种实验进一步证实， 它对调节免疫所起的重要作用。 这进一步提示该因子可能是关闭免疫应答的信号。 由于它具有显著的免疫抑制作用， 故用于自身免疫性疾病的治疗将成为一种可能。
本实验应用逆转录 PCR (RT-PCR) 的技术， 从转录水平认识细胞免疫应答在本病中的重要作用。 RT-PCR 是一种较为先进、 敏感的技术， 通过基因放大使得细胞因子在 mRNA 水平上的表达易于检出。 mRNA 表达的研究仅在转录水平， 更深入的认识还需弄清转录后发生的蛋白修饰作用或蛋白分泌的调节过程， 有待今后进一步探讨。
参考文献
1 Poser CM, Paty DW, Scheinberg L. New diagnostic criteria for Multiple Sclerosis: guidelines for research protocols. Ann Neurol, 1983, 13:227-231
2 McDonald WI. The mystery of the origen of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1986, 49:434-445
3 Hartung HP. Immune-mediated demyelination. Ann Neurol, 1993, 33:563-567
4 Schattner A. Lymphokines in autoimmunity-a critical review. Clin Immunol Immunopatrh, 1994, 3:177-189
5 林嘉友， 赵武述. 细胞因子及其在临床诊断和治疗中的应用. 中华医学检验杂志， 1996， 19(3)：135-136
6 毕爱华， 医学免疫学. 北京：人民军医出版社， 1996. 60-68
7 Shull MM, Ormsby I, kier AB, et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-gene results in multifocal inflammatory disease. Nature, 1992, 359:693-699
8 Racke MK, Bonomo A, Scott DE, et al. Cytokine induced immune deviation as a therapy for inflammatory autoimmune disease. J Exp Med, 1994, 180:1961
9 Steven I, Gould KE Swanborg RH. Transforming growth factor-β 1 inhibits tumor necrosis factor-α/β production and adoptive transfer of disease by effector cells of autoimmune encephaloyelitis. J Neuroimmunol, 1994, 51:77-83
10 Howard MO, Garra A. Biological properties of interleukin-10: immunol. Today, 1992, 13:198-200
11 Shohreh Issazadeh. Cytokines in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis in DA rats: persistent mRNA expression of proinflammatory cytokines and absent expression of interleukine-10 and transforming growth factor-β. J Neuroimmunol, 1996, 69:103-115
(1998-10-12收稿)