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IL-1受体相关激酶1和2协同调控IL-1诱导的NF-κB活化
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基础免疫学
作者：郭甫坤 李亦蕾 吴曙光
单位：第一军医大学药物研究所
关键词：白细胞介素1；白细胞介素1受体相关激酶；反义寡核苷酸；核因子-κB
【 摘要 】 目的 研究白细胞介素1受体相关激酶1（IRAK-1）和IRAK-2在白细胞介素1（IL-1）诱导核因子-κB（NF-κB）活化中的作用。 方法 Lipofectin介导反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸转染HepG2细胞。用逆转录PCR法检测IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达水平，以夹心ELISA法检测NF-κB的活化。 结果 (1) 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达。(2) 反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸部分抑制NF-κB活化，最高抑制率分别为(34.6±0.9)%和(54.5±0.2)%。(3) 反义IRAK-1寡核苷酸与反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞对NF-κB的抑制作用明显增强，抑制率达(77.5±0.9)%。 结论 IRAK-1或IRAK-2调控NF-κB活化，但不能完全激活NF-κB；IRAK-1和IRAK-2协同调控IL-1诱导的NF-κB活化。
Interleukin-1 receptor associated kinase-1 and -2 synergetically activate NF-κB
GUO Fukun, LI Yilei, WU Shuguang
（Institute of Pharmaceutic Sciences, The First Military Medical University, Guangzhou 510515, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To investigate whether interleukin-1 receptor associated kinase-1 (IRAK-1) and IRAK-2 are functionally synergetic or redundant but differentially expressed in interleukin-1 (IL-1)-induced nuclear factor-κB(NF-κB) activation. Methods Phosphorothioate oligonucleotides (ODN) were designed antisense to sequences of IRAK-1 or IRAK-2. Antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured HepG2 cells. IRAK-1 mRNA and IRAK-2 mRNA expression were assayed by semiquantitative reverse transcription-PCR. The levels of NF-κB were measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK-1 ODN and antisense IRAK-2 ODN blocked IRAK-1 and IRAK-2 expression, respectively. As a result, antisense IRAK-1 ODN or antisense IRAK-2 ODN inhibited IL-1-induced NF-κB activation in a dose (1-8μg ) and time (5-24 h) dependent fashion. When the cells were treated with antisense IRAK-1 ODN (4μg) or antisense IRAK-2 ODN (4μg) for 8 h, maximum inhibition rates of 34.6%±0.9% and 54.5%±0.2%, respectively, were observed. Cotransfection of antisense IRAK-1 ODN with antisense IRAK-2 ODN resulted in an additive inhibition of NF-κB-activation by 77.5%±0.9%. Conclusion These data suggest that either IRAK-1 or IRAK-2 is necessary but not sufficient to activate NF-κB and that IRAK-1 regulate IL-1-stimulated NF-κB activation in cooperation with IRAK-2.
【 Subject words 】 Interleukin-1; Interleukin-1 receptor associated kinase; Antisense oligonucleotide; Nuclear factor-κB
白细胞介素-1（IL-1）是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子。越来越多的研究表明，IL-1的生物学效应主要由转录因子核因子-κB（NF-κB）调控〔1〕。因此，阐明IL-1活化NF-κB的机制显得尤为重要。
IL-1刺激信号由其Ⅰ型受体（IL-1RⅠ）转导。与大多数细胞因子受体不同，IL-1RⅠ没有内在的蛋白激酶活性〔2〕，因而势必需要结合细胞浆蛋白激酶来传导信号。IL-1受体相关激酶-1（IRAK-1）和IRAK-2就属于这样的蛋白激酶。研究表明，IRAK-1和IRAK-2都能通过下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6 （TRAF6）激活NF-κB〔3,4〕。但是，目前还不清楚它们是否协同作用，本文对此进行了探讨。
材料与方法
细胞系和试剂：HepG2细胞从ATCC公司购买，DMEM和lipofectin从Gibco BRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基羧基末端)和兔NF-κB p65亚基特异性抗体(抗原表位相应于人源NF-κB p65亚基氨基末端)由美国SantaCruZ生物技术公司生产。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒为Promega公司产品。
细胞培养〔2〕：HepG2细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃，5% CO2条件下培养至汇合成片。
寡核苷酸的序列及合成：反义IRAK-1寡核苷酸序列：5′-CCCCCCGGCCATGGCTGC-3′; 正义IRAK-1寡核苷酸序列: 5′-GCAGCCATGGCCGGGGGG-3′。反义IRAK-2寡核苷酸序列: 5′-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3′; 正义IRAK-2寡核苷酸序列：5′-ATGGCCTGCTACATCTAC-3′。寡核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成。寡核苷酸的5′端和3′端各3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义寡核苷酸序列与靶序列一致。反义寡核苷酸序列与靶序列互补。
Lipofectin包裹寡核苷酸的制备：参照lipofectin说明书操作。
RT-PCR测定IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml刺激30min，洗去IL-1β，IRAK-1实验组分别加入正义IRAK-1寡核苷酸4μg和反义IRAK-1寡核苷酸4μg；IRAK-2实验组分别加入正义IRAK-2寡核苷酸4μg和反义IRAK-2寡核苷酸4μg，各实验组均设立对照。细胞与寡核苷酸孵育8h，提取总RNA，RT-PCR扩增。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用BIO-PROFIL/BIO-CAPT/BIO-1D++图像分析软件（VILBER LOURMAT公司）定量。IRAK-1 5′端引物为：5′-ACTTCTTGTACGAGGTGCCGCC-3′; 3′端引物为：5′-GGGCAGGCCTGGGTCTGGCAGT-3′。IRAK-2 5′端引物为：5′-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3′; 3′端引物为：5′-CCAGCACAGGTAA GACATTGG-3′。内参照β-actin 5′端引物为 5′-TGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′; 3′端引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(由上海生工生物工程有限公司合成)。重复实验3次。
夹心ELISA法测定NF-κB：按Rovin等人〔5〕的方法提取细胞核蛋白，用夹心ELISA法测定NF-κB。山羊NF-κB p65亚基特异性抗体3mg/L包被酶联板，每孔100μl，4℃过夜。PBS洗5次后加1% BSA(每孔100μl)，4℃封闭过夜。洗去未结合的BSA，加入经1∶500稀释的待测样品(每孔100μl)，37℃保温2h。洗去未结合的样品，每孔加100μl经1∶500稀释的兔NF-κB p65亚基特异性抗体，37℃保温2h。洗去未结合的抗体，每孔加100μl经1∶1000稀释的HRP标记抗体，37℃保温2h。洗去未结合的酶标抗体，加OPD 2mmol/L(含0.006% H2O2)(每孔100μl)，37℃保温1h。反应用柠檬酸2mol/L(每孔50μl)终止。测量450nm处的吸光度值。实验设立山羊NF-κB p65亚基特异性抗体和兔NF-κB p65亚基特异性抗体对照组以及BSA无关对照组。重复实验3次。
数据分析：实验数据以
结果
1.反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别对IRAK-1和IRAK-2表达的影响：以IRAK-1或IRAK-2 PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin PCR产物吸收峰体积的比值反映反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸对各自的靶基因表达的影响。结果表明，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1和IRAK-2表达（与对照组相比，P＜0.01），而正义IRAK-1寡核苷酸和正义IRAK-2寡核苷酸都不能抑制靶基因表达（图1A、B）。
2.反义IRAK-1寡核苷酸对NF-κB活化的影响：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml刺激30min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-1寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1h。同时设立对照组（细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-1寡核苷酸）和基础组（细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-1寡核苷酸）。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-1 寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图2A)。4μg反义IRAK-1寡核苷酸与细胞孵育8h的抑制作用最强，NF-κB的吸光度(A)值从对照组的2.179±0.029降至1.422±0.029，抑制率为(34.6±0.9)%(图2B)。但是此时的NF-κB活性仍远高于基础NF-κB水平（NF-κB基础水平值为A=0.157±0.003，图2B)，说明反义IRAK-1寡核苷酸不能完全抑制NF-κB活化。上述结果意味着IRAK-1调控NF-κB的活化但不足以激活NF-κB。
3.反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB活化的影响：汇合成片的细胞用IL-1β 100U/ml 刺激30min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸孵育一定时间，洗去反义寡核苷酸，IL-1β刺激1h。同时设立对照组（细胞接受IL-1刺激但不转染反义IRAK-2寡核苷酸）和基础组（细胞既不接受IL-1刺激也不转染反义IRAK-2寡核苷酸）。提取各组细胞核蛋白，检测NF-κB水平。结果表明，反义IRAK-2寡核苷酸呈时间和剂量依赖性地抑制NF-κB活化(图3A)。当4μg反义IRAK-2寡核苷酸与HepG2细胞共孵育8h时，NF-κB的吸光度值降幅最大，从对照组的A=2.371±0.051下降到1.079±0.006，抑制率达(54.5±0.2)%（图3B）。然而，与反义IRAK-1寡核苷酸类似，反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB的抑制不完全（图3B）。预示虽然IRAK-2在IL-1诱导的NF-κB活化中起重要的调节作用，但IRAK-2只能部分激活NF-κB。
图1 反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1表达的影响(A)，反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2表达的影响(B)
Fig 1. Effect of antisense IRAK-1 ODN on IRAK-1 expression (A)， Effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 expression (B)
S-1: Sense IRAK-1 ODN; S-2: Sense IRAK-2 ODN; AS-1: Antisense IRAK-1 ODN; AS-2: Antisense IRAK-2 ODN; V: Volume of peak
Compared with control,**P＜0.01
图2 反义IRAK-1寡核苷酸对NF-κB活化的影响
Fig 2. Effect of antisense IRAK-1 ODN on NF-κB activation
Compared to control,**P＜0.01
AS-1： Antisense IRAK-1 ODN
图3 反义IRAK-2寡核苷酸对NF-κB活化的影响
Fig 3. Effect of antisense IRAK-2 ODN on NF-κB activation
Compared with control,**P＜0.01
AS-2： Antisense IRAK-2 ODN
4.反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对NF-κB活化的影响：虽然IRAK-1和IRAK-2都在IL-1诱导的NF-κB活化中起调控作用，但任何一个都不足以激活NF-κB。由此我们推测这二个早期信号转导子在激活NF-κB时协同作用。为了验证这一假设，我们将4μg反义IRAK-1寡核苷酸和4μg反义IRAK-2寡核苷酸共转染HepG2细胞。保温8h。结果达(77.5±0.9)%的NF-κB活性被抑制(图4)，说明IRAK-1和IRAK-2确实是协同起作用。
图4 反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染对NF-κB活化的影响
Fig 4. Effect of cotransfection of antisense IRAK-1 ODN with antisense IRAK-2 ODN on NF-κB activation
AS-1: Antisense IRAK-1 ODN; AS-2: Antisense IRAK-2 ODN
讨论
本研究结果发现，IRAK-1和IRAK-2各自都能调控IL-1诱导的NF-κB活化，但都不足以激活NF-κB，IRAK-1和IRAK-2在调控NF-κB活化时协同作用。
近年来，反义寡核苷酸因其作用高度特异而被用作一种疾病治疗策略或理论研究工具〔6〕。反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸分别抑制IRAK-1 mRNA和IRAK-2 mRNA表达，而对看家基因β-actin的表达无抑制作用（图1），所以反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸可分别作为IRAK-1和IRAK-2表达的特异性抑制剂。
反义IRAK-1寡核苷酸对IRAK-1表达的抑制导致IL-1诱导的NF-κB活化被抑制，但这种抑制是不完全的（图2），说明IRAK-1是NF-κB活化必要但不充分的条件。这一点不同于IRAK-1过度表达足以激活NF-κB的报道〔3〕。由于IRAK家族另一成员IRAK-2具有与IRAK-1相似的作用（图3），因此IRAK-1和IRAK-2很可能协同激活NF-κB。此推测为下述实验结果证实：与反义IRAK-1寡核苷酸或反义IRAK-2寡核苷酸单独转染HepG2细胞相比，两者共转染细胞对NF-κB的抑制作用明显增强（图4）。但是，反义IRAK-1寡核苷酸和反义IRAK-2寡核苷酸共转染后NF-κB活性仍未降至基础水平（P＜0.01，图4），提示还可能存在别的蛋白激酶与IRAK-1和IRAK-2一起调控NF-κB活化。
IRAK-1和IRAK-2之间关系的澄清可为抑制IL-1的炎症反应提供理论指导。但是，IRAK-1和IRAK-2协同作用的分子机制有待阐明。另外，由于IL-1信号转导极其复杂，IRAK-1和IRAK-2在激活NF-κB时的协同作用是否存在于其它细胞和体内也需证实。
参考文献
1，O′Neill LAJ, Greene C. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and plants. J Leukoc Biol, 1998, 63:650-657.
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5，Rovin BH, Dickerson JA, Tan LC, et al. Activation of nuclear factor-κB correlates with MCP expression by human mesangial cells. Kidney Int, 1995, 48:1263-1271.
6，Stepkowski SM. Application of antisense oligodeoxynucleotides for organ transplantation. Transplant Proc, 1998, 30:2142-2145.
(收稿日期：1999-07-24)