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转基因小鼠研究进展
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 综述
作者：郭长占
单位：北京医科大学免疫系
编者按：自本世纪70年代建立的单克隆抗体技术用于免疫学领域的研究，迄今已能鉴定约166种免疫细胞及其相关细胞表面分子，使免疫学的研究进入了分子免疫学时期。探讨这些免疫分子的结构和功能已提到了日程。
藉助分子生物学技术进行了相关基因克隆，并对其编码蛋白分子的氨基酸序列进行了分析，阐明了相关免疫分子的分子结构。但对这些特殊分子功能的研究，单纯的氨基酸序列分析尚不足以说明其在生命过程中的作用，只有应用遗传学方法，才能确定特定基因及其编码蛋白分子在细胞活动中的作用。
经典遗传学方法只能对简单有机体(如单细胞生物细菌与酵母；多细胞生物果蝇和蠕虫)进行生物学过程分析，但不适用于复杂有机体(哺乳类)的生物学分析。而分子遗传学方法则可用于复杂有机体生物学分析，用以研究这些大分子在个体发育、免疫系统及中枢神经系统的发生，以及生理与病理过程中的作用。因此只有应用转基因动物使相关基因通过表达、排除或突变，检测其在转基因动物体内对生理功能的影响，才能确定相关基因及其编码蛋白分子的生物学意义。
国内在兽医方面开展了一些转基因动物的研究工作，但很少涉及到免疫学的应用。本文概括的介绍了转基因小鼠技术的研究进展及其在免疫学研究中所取得的部分资料，反映了现代分子免疫学的研究水平，很有参考意义。
郭长占综述 龙振洲审校
转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠(transgenic mice)。由于转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力，因此转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系已经得到越来越广泛的应用。
以往的转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。因为在一个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、相互影响的。而且，一个基因在单一细胞中的表达究竟会对整个机体的生理功能产生什么作用也必须在整体水平来研究。从60年代开始，生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法，将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内，以便研究基因的功能及调控规律。到70年代中期，几种将外源基因导入早期哺乳动物胚胎的方法逐步建立起来，从而为建立转基因小鼠奠定了基础。1982年，美国学者Palmiter〔1〕将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。
一、转基因小鼠技术发展
转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段。
第一阶段：实现外源基因的导入。1974年，Jaenisch等〔2〕用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。这一阶段转基因技术的共同特点是导入的外源基因是随机整合的。这种随机整合的外源基因可能是单拷贝的，也可能是多拷贝的。外源基因整合的结果可能会有几种情况出现：①能够有效地表达，且不影响动物的发育以及正常的生理功能。②不能有效表达，整合入动物细胞基因组中的外源基因无功能。③外源基因的整合导致动物细胞正常基因的失活或激活癌基因，这样动物则不能正常发育、繁殖。
第二阶段：导入的外源基因与内源基因同源重组。 1987年，Utah大学Capecchi〔3〕领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入的外源基因的定点整合，这一技术亦称为“基因打靶”(gene targeting)。基因打靶技术的应用，一方面可以使导入的外源基因定点整合于人们希望整合的部位，从而避免了外源基因随机整合对内源基因的影响；另一方面，人们还可以利用基因打靶技术定点灭活一个内源基因，亦称为“基因敲除”(gene knockout)。因此，基因打靶技术为在整体水平研究某一基因的功能以及进行基因的修正，即基因治疗开辟了新的途径。
第三阶段：实现导入的外源基因组织特异性表达。 尽管基因打靶技术的应用实现了外源基因的定点整合，但整合入的外源基因要随着生殖细胞的发育进入各种组织细胞，这样外源基因的表达就没有组织特异性，因而无法研究某一基因在特定组织中的功能。随着一系列组织特异性启动子的发现和应用，导入的外源基因逐步实现了在特定组织细胞内的表达。表达的调控手段各异，如应用重金属元素、热休克蛋白和甾体激素等。这样就使得对转入的外源基因功能的研究更精确了〔4〕。
第四阶段：导入的外源基因在动物发育阶段上的可控表达。外源基因如果不影响动物的胚胎发育，则携带有外源基因的动物可以生长，发育成熟，但有时导入的外源基因会影响动物的胚胎发育，导致动物在胚胎阶段死亡。为了克服这一弊端，必须要找到一种可以人为控制外源基因在特定发育阶段进行表达的方法。1993年，Gu等〔5〕应用Cre/loxP重组酶系统实现了外源基因的时间特异性表达。现在已经能够从时间和空间的角度控制外源基因的表达并观察其功能。
二、转基因小鼠的制备原理与方法
(一)转基因小鼠制备的基本程序〔6〕：(1)选择小鼠品系，可以用远交系也可以用近交系。(2)准备不育雄鼠和假孕母鼠。(3)收获受精卵。(4)将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫内使之发育。(5)首建转基因鼠(founder)中外源基因整合的检测。(6)通过繁育建立转基因小鼠品系。其流程见图1。
图1 转基因小鼠制备的一般实验流程
(二)外源基因导入方法：(1)显微注射法。(2)逆转录病毒载体法。(3)电脉冲法。
三、基因打靶技术在转基因小鼠制备中的应用
(一)基因打靶的原理： 基因打靶是根据同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合，而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。基因打靶的结局有如下可能：(1)靶基因被灭活，即基因敲除，当打靶载体中插入一个特定的DNA序列就可以实现基因敲除。(2)靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的基因。(3)在受体细胞基因组中定点引入一个原本不存在的完全新的基因，称之为基因击入(gene knockin)。
(二)基因打靶的方法：进行基因打靶要经历以下步骤：构建打靶载体、打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞，即ES细胞)、打靶ES细胞导入囊胚、囊胚植入假孕母鼠子宫发育〔7〕。
1.打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序列(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。HRDS一般用基因组DNA而不用cDNA，因cDNA容易造成缺失或其它改变，长度可从3kb至15kb。依据打靶载体插入受体细胞基因组的方式不同，打靶载体可分为两种类型。一种称为O型载体，这种打靶载体在与靶基因发生同源重组时将全部插入到靶基因特定位点中，因此亦称插入型载体。插入型载体一般用于基因击入(gene knockin)和基因敲除(gene knockout)。另一种类型的打靶载体称为Ω型载体，这种打靶载体在与靶基因同源重组时HRDS之间外源基因将取代受体细胞基因组与HRDS同源序列之间的基因，因此，除可用于基因击入、基因敲除外，还可用于基因修正(gene repairment)。
2.外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎的(孕3～5d)内细胞团(inner mass)分离的细胞。1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。外源基因导入ES细胞的方法有电击法、逆转录病毒载体法、脂质体包装法以及磷酸钙沉淀法等。外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法，其基本原理是：在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neor)插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标志；在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因序列作为负选择标志。如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组，外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV-tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neor基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来。如果导入的外源基因与细胞基因组随机整合，则从头至尾全部整合入靶细胞基因组中，这种情况下，标志基因neor及HSV-tk同时表达。neor基因的产物使细胞具有G418抗性，而HSV-tk基因的产物使细胞利用ganciclovir(GANC,丙氧鸟苷)转变为毒性物质导致细胞死亡。这样存活下来的细胞必定是发生了同源重组的细胞。筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。
3.转基因小鼠的繁育： 用基因打靶的方法产生的第一次子鼠为嵌合体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来，因此并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因。为获得纯合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交(back-cross)。回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠(-/-)，即其完全不携带有外源基因，也有杂合的小鼠(-/+)。再用杂合子小鼠互交（intercross），从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因打靶小鼠。再经繁育可建立转基因小鼠品系。其实验流程见图2。
图2 基因打靶的一般实验流程
表1 用基因打靶法产生的一系列重要的基因敲除小鼠及表型〔8〕
| 敲除基因 | 表现型 |
| RAG-1和/或RAG-2 | 因无TCR基因重排而无T细胞 |
| TCRβ | 双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞极少，TCRα正常重排 |
| TCRα | 有双阴性和双阳性T细胞而无单阳性T细胞 |
| P56lck | T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无γ δ T细胞 |
| CD3-ζ | T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻 |
| CD45 | T细胞发育在双阳性成熟期受阻 |
| MHCⅡ，不变链 | 无CD4+T细胞，CD4+CD8-/+极少，NK1.1+CD4+正常，CD8+正常 |
| CD4 | CD8+数量和功能正常 |
| MHCⅠ，β-2微球蛋白 | 无CD8+ T细胞，CD4+ T细胞正常 |
| TAP1/TAP2 | |
| TCR-δ | 无γ δ T细胞，对结核杆菌易感性增加 |
| P59fyn | T细胞发育正常，成熟T细胞应答缺损 |
| IgM穿膜区 | 晚期CD43+ B聚集，无等位基因排斥 |
| λ5 | CD43+细胞聚集，部分成熟B细胞出现延迟 |
| IL-2 | IgG1、IgG2a、IgG2b自身抗体增加 |
| CD40L | 高IgM，无生发中心，低IL-12和IFN-γ，巨噬细胞活化受阻 |
| CD28 | IgG1、IgG2b减少 |
(三)组织特异性基因打靶： 应用ES细胞和同源重组原理而发展起来的基因打靶技术使转基因动物的研究又向前迈进了一步，但仍有其局限性。主要问题是，虽然通过基因打靶实现了外源基因在受体细胞基因组中的定点整合，但这种整合是没有组织特异性的，因此尚不能使外源基因仅在特定的组织中表达。Cre/loxP系统的发现及应用实现了外源基因的组织特异性表达。loxP (locus of crossing over (x),P1)位点是由34对核苷酸为基本单位构成的DNA重复序列。来自P1噬菌体的Cre (causes recombination)重组酶可特异地识别loxP位点而使两个位点之间的DNA序列发生重组，其机制是Cre重组酶可在loxP位点中切开DNA序列而造成粘性末端。如果两个loxP位点 DNA序列方向相同(头-尾相对)，它们之间的DNA序列连同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的DNA序列方向相反(头-头相对)，它们之间的DNA序列则被调转方向。根据这一原理，在构建打靶载体时在靶基因同源DNA序列两侧引入loxP位点及选择性标志基因。然后按经典的基因打靶方法制备转基因小鼠。由于loxP位点不影响基因的表达，因此转基因小鼠体内除带有选择性标志基因外，其表型完全是正常的，只不过体内所有细胞靶基因两侧均含有loxP位点。第二步是再构建另一种转基因小鼠，这种转基因小鼠能在特定的组织中表达Cre重组酶，方法是Cre重组酶基因要构建在特定的启动子下游。如lck启动子只在发育的T细胞中表达，将Cre重组酶基因构建在lck启动子下游，制备转基因小鼠。然后用这两种转基因小鼠杂交，后代中阳性重组鼠则仅在T细胞中表达Cre重组酶，这样便可实现仅在T细胞中的基因打靶。
(四)外源基因的时间可控性表达：实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表达在动物发育不同阶段中的作用。另外，由于外源基因表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期死亡。为了解决这一问题，Mentzger等人(1995)用编码Cre重组酶与人雌激素受体(estrogen receptor,ER)融合蛋白的基因制备Cre-ER转基因小鼠，给这种转基因小鼠注射人雌激素，可诱导Cre-ER的大量表达。再用插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种转基因小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反，则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。例如，为了使导入的外源基因只在B细胞中表达，可利用B细胞特有的CD19启动子控制外源基因的启动，将外源基因插入两个loxP位点之间(两个loxP序列的方向相反)。这样制备的转基因小鼠将依赖Cre重组酶将携带的外源基因调转方向后才能在B细胞中表达。用这两种转基因小鼠杂交，后代中阳性重组鼠则仅在B细胞中表达外源基因，而且可以用注入人雌激素控制表达的时间。这样既可使外源基因仅在B细胞中表达，而且表达的时间也可人为控制。目前在免疫学研究中用基因打靶的方法制备的主要基因敲除小鼠见表1。
四、转基因小鼠在免疫学研究中的应用
(一) 免疫耐受机制的研究： 免疫系统的功能一方面表现为对“非己”抗原的识别和排除，另一方面表现为对“自己”抗原的耐受。自身耐受的形成机制复杂，目前认为包括：克隆排除、克隆不应答、抑制性T细胞（TS）的作用以及独特型网络调节等。用转基因小鼠的方法将外源基因导入小鼠受精卵，这样其基因产物在胚胎发育的一定阶段表达后就完全作为“自己”抗原被免疫系统识别而产生耐受。Hanahan等〔9〕用大鼠胰岛素启动子与SV40的基因制备转基因小鼠，导入的基因组织特异性地在胰岛β细胞中表达，并通过控制其在β细胞中的表达时间，发现SV40 T抗原在胚胎发育不同阶段的表达对免疫耐受的形成是不同的。早期表达SV40 T抗原的小鼠表现了对此抗原的耐受，小鼠胰腺组织正常，但胚胎晚期表达SV40 T抗原的小鼠不产生对该抗原的耐受，因而产生抗自身胰岛β细胞的抗体，胰岛β细胞被破坏，出现自身免疫性糖尿病。这些结果不但表明胚胎期接触某种抗原可以形成耐受，而且还与胚胎发育的阶段有关，为认识自身耐受的形成机制提供了新的依据。
(二) 建立免疫性疾病动物模型： 自身免疫性疾病已经成为常见病、多发病，因此建立相应的动物模型对于研究发病机理是十分必要的。有人用自身抗体基因制备转基因小鼠，如Erikson等人将自身抗体基因导入小鼠后，转基因小鼠的B细胞大量分泌自身抗体并引发SLE样自身免疫病。Okamoto等〔10〕将抗小鼠红细胞的单克隆抗体基因导入小鼠受精卵制备转基因小鼠，小鼠产生了抗红细胞的抗体，引起了自身免疫性溶血性贫血。目前已有一系列的自身免疫性疾病的转基因小鼠模型，为深入研究自身免疫病的病因、发病机制创造了有利的条件。
(三) 用转基因小鼠研究免疫分子的功能：为了深入研究免疫分子的功能，用转基因小鼠或基因打靶小鼠的方法可以获得更接近于机体内真实情况的资料。例如要了解白细胞介素的功能，可以建立白细胞介素基因敲除小鼠，然后观察不表达该白细胞介素小鼠有何异常表现。IL-2是免疫系统中一个非常重要的细胞因子，但IL-2基因敲除小鼠的细胞免疫并无异常，可能的机制是IL-2的功能可由其它细胞因子代偿。而IL-2R γ基因敲除小鼠则出现严重的细胞免疫缺陷，说明IL-2R γ对免疫细胞的功能是十分重要的。根据同样的原理，已用转基因小鼠或基因敲除小鼠对其它一些细胞因子以及受体分子的功能进行了研究，并有很多重要的发现〔11〕。
随着转基因小鼠技术的日臻完善，转基因小鼠已经成为免疫学研究中的新一代实验动物体系，并对免疫学的发展产生了推动作用。龙振洲（北京医科大学免疫系）
参考文献
1 Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with a metallothionein-growth hormone fusion gene. Nature, 1982, 300:611-615.
2 Jaenisch R, Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocytes injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1974, 71:1250-1254.
3 Kirk R, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell, 1987, 51:503-512.
4 Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage Pl. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:5166-5170.
5 Gu H, Zou YR, Rajewskey K. Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-Mediated gene targetting. Cell, 1993, 73:1155-1164.
6 Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994,117-119.
7 Fassler R, Martin K, Forsberg E, et al. Knockout mice: How to make them and why. The immunological approach. Int Arch Allergy Immunol, 1995, 106:323-324.
8 Cid-Arregui, Garcila-Carranca. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Berlin, Springer-Verlag, 1997, 521-560.
9 Hanahan D. Heritable formation of pancreatic β-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature, 1985, 315:115-122.
10 Okamoto M, Murakami M, Shimizu A, et al. A transgenic model of autoimmune hemolytic anemia. J Exp Med, 1992, 175:71-79.
11 Huang S, Hendriks W, Althage A, et al. Immune response in mice that lack the interferon-γ receptor. Science, 1993, 259:1742-1745.
(收稿日期：1999-01-20)