分子信标用于结核分枝杆菌的均相荧光PCR检测

分子信标用于结核分枝杆菌的均相荧光PCR检测

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 检测技术

作者：李庆阁　梁基选　栾国彦　张洋

单位：李庆阁（361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室，厦门大学生物学系）；梁基选（厦门大学抗癌中心）；栾国彦（厦门泰伦生物工程有限公司）；张洋（厦门泰伦生物工程有限公司）

　　1996年Tyagi等^〔1〕提出的分子信标是一种具有颈环构型的分子探针，用于PCR扩增产物均相测定的原理是，在退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，则脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度便与模板量成正相关。我们在原来“分子信标”原理基础上，对其设计思想进行了重要改进，合成出效率更高的分子信标，并自行研制了简便适用的荧光测定装置。本文报告用于结核分枝杆菌的检测结果。

　　材料和方法

　　菌株：分枝杆菌属包括堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌、海分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、母牛分枝杆菌、胃分枝杆菌、草分枝杆菌；其它菌株包括肺炎球菌、布氏菌、大肠杆菌、百日咳菌。结核分枝杆菌菌液含量分别为10³、10²、10¹、10⁰菌/ml。所有菌株均由中国药品生物制品检定所提供。

　　引物与分子信标探针：选择结核杆菌插入序列IS 986设计一对引物^〔2〕，引物1为5′-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3′，引物2为5′-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3′。该对引物对人型结核杆菌、牛型结核杆菌、卡介苗菌、非洲分枝杆菌及田鼠分枝杆菌有特异扩增产物，扩增片段长度为245bp。

　　在设计分子信标时，我们认为将互补序列延伸至发夹臂部分不会影响发夹的作用，不仅提高了分子信标的利用率，还能增加与模板结合后的分子信标中荧光染料和猝灭剂之间的距离，更有利于荧光的恢复。实验中取两引物之间一段序列，经OLIGO4.0软件分析设计为，5′FAM-GGC TGA TGA CCA AAC TCG GCC TGT CCA GCC-DABCYL-3′（划线部分为发夹臂互补序列，斜体为与模板无关序列）。引物由上海生工生物工程公司合成。分子信标自行合成、标记，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

　　PCR测定：取痰液标本1ml经2ml 1mol/L NaOH液化，取中层500μl，15000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加三蒸水500μl，混匀，14000r/min离心10min，弃上清，留取沉淀，加50μl样品提取液（2% Triton X-100、1%NP-40），混匀，置沸水浴100℃ 15min，14000r/min离心5min。取上清备用。其它标本直接取500μl，14000r/min离心10min。后按痰液标本同样处理后，取上清备用。25μl PCR反应体系内含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl, 1.0U Taq酶(Promega)，200μmol/L dNTP(Pharmacia)，1.5mmol/L MgCl₂，0.4μmol/L 引物和0.4μmol/L分子信标及5μl样本溶液。在热循环仪（MJ/PTC-100型，基因公司）上94℃预变性5min后，按94℃ 30s，65℃ 1min和72℃ 1min运行40个循环，94℃变性30s后 ，于65℃退火1min结束。然后将PCR反应管置于荧光计（TD-360, Turner Designs）的微量样品架(自行研制)上测定荧光强度。以3SD法判断阴阳性。

　　特异性和灵敏度测定：分别对其它分枝杆菌、非分枝杆菌、结核分枝杆菌及10倍连续稀释的卡介苗进行PCR扩增，然后依次进行琼脂糖凝胶电泳检测和均相荧光PCR检测。

　　临床样本检测：取结核病患者痰液标本316例和正常标本150例（福州市肺科医院，厦门市结核病院）分别用涂片法和均相荧光PCR进行检测。另取其中54例进行培养观察。

　　结果与讨论

　　1.分子信标用于结核分枝杆菌的均相荧光PCR测定：不同循环数测定TB标准浓度（菌数/ml）0、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵的结果，如图1所示，循环数较少时（21～28），各个浓度都未有荧光强度的明显变化，随着循环数的增加，高浓度TB样品的荧光首先增加，38～40个循环后，本底荧光依然增加微小，而各个样品的荧光强度与对应的浓度已呈明显的正相关。本实验的每个数据都是由不同的反应管获得的，所获得的荧光强度的变化趋势及其与浓度的正相关关系和预期结果一致，证实了方法的可行性。

　　图1　分子信标用于不同稀释度结核分枝杆菌的均相荧光PCR检测

　　2.特异性和灵敏度：用均相荧光PCR检测其它分枝杆菌和非分枝杆菌均显示阴性。结核杆菌则呈阳性。采用结核分枝杆菌菌液（含量分别为10³、10²、10¹、10⁰菌/ml）可检出1～10菌/ml。用“冻干皮内注射用卡介苗”进行10倍连续稀释，琼脂糖凝胶电泳可检测至10^-5样品浓度，均相荧光PCR可检测至10^-6样品浓度，显示出更高的灵敏度。

　　3.标本的检测：取疑有结核分枝杆菌的痰液标本共计316例，分别用涂片法、培养法和均相荧光PCR法进行检测，结果见图2。

　　以上结果表明，对于涂片法和培养法检出为阳性的样本，荧光PCR法的灵敏度分别为92.2%和95%，特异度分别为57.9%和55.9%。对于正常阴性标本，均相荧光PCR法与涂片法符合率为100%。荧光PCR法的阳性检出率（65.8%）显著高于涂片法（32.6%）和培养法（37.0%），显示均相荧光PCR法具有更高的敏感性。均相荧光PCR测定法省却了PCR后处理过程，不仅大大提高了样品的分析速度，简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染。利用自行研制的微量PCR样品管架，可在普通荧光计上实现定性和半定量测定。本文结果为分子信标大规模用于PCR诊断提供了模式。

图2　涂片法、培养法、荧光PCR法检测结果

参考文献

　　1，Tyagi S, Kramer FR. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization. Nature Biotechnology, 1996, 14:303-308.

　　2，Kolk AHJ, Schuitema ARJ, Kuijper S, et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a non-radioactive detection system. J Clin Microbiol, 1992, 30:2567-2575.

(收稿日期：1999-05-31)