重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 分子与细胞免疫学

作者：任政华　房廉洁　刘宝全　李一经　孙国光

单位：任政华　房廉洁　(白求恩医科大学第三临床学院外科研究所，长春130031)；刘宝全　李一经　(东北农业大学，哈尔滨150021)；孙国光　(白求恩医科大学基础医学院，长春130021)

关键词：狂犬病毒N蛋白；狂犬病毒基因重组；白细胞介素-2

　　摘　要　目的：探讨狂犬病毒N蛋白的免疫原性。方法：采用生物工程技术、基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及IL-2基因文库设计两对引物，基因扩增后分别得到完整狂犬病毒N蛋白基因片段(1.4 kb)和IL-2基因片段(0.4 kb)，两基因片段经重组后，构建了狂犬病毒N蛋白及IL-2重组基因工程菌。重组基因产物具有特异性生物活性。用IL-2单抗检测有一定IL-2活性。免疫小鼠后，小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击。结论：采用的载体及方法、路线可行，重组产物具有生物活性。

　　中国图书分类号　R373.9

Expression of recombinant rabies virus in Escherichia Coli

REN Zheng-Hua,FANG Lian-Jie,LIU Bao-Quan^① et al.

　　Third Clinical Hospital of Bethune Medical University,Changchun 130031.^①Northeast Agricultural University,Harbin150021

　　Abstract Objective:Study immunogenicity of rabies virus nucleoprotein.Methods:Molecular biology and gene recombination.Results:Had designed two pairs of inductive substance based on gene library of rabies virus and IL-2.After amplification,obtained a gene section of IL-2 of 0.4 kb and one of rabies nucleoprotein of 1.4 kb.With recombination of the two sections,obtained nucleoprotein of rabies virus and IL-2 recombinant.The substance obtained is bio-active and possess certain IL-2 activity.It could induce resistance to rabies virus challenge to the head of the mice.Conclusion:Obtained to activity material from the test.

　　Key words Rabies virus nucleoprotein Rabies virus recombinant IL-2

　　狂犬病毒核蛋白(NP)，长期以来一直被认为是结构蛋白，是病毒遗传的主要成分，不具有抗原性^［1］。近年来许多专家相继报道核蛋白的免疫保护作用^［2］。核蛋白主要作用表现在刺激机体免疫活性细胞增殖，促进细胞免疫，参与免疫调节^［3］。但核蛋白只能刺激细胞免疫，不产生中和抗体，核蛋白的免疫原性并不十分理想。为提高核蛋白的免疫原性及生物学效应，本研究通过基因重组方法引入IL-2基因，从而提高核蛋白的免疫原性，达到预防、治疗狂犬病的目的。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　狂犬病毒株CVS由中国药品生物制品检定所提供。

　　1.1.2　白细胞介素-2质粒含IL-2全基因片段由美国Feris实验室赠送。

　　1.1.3　实验中所用的内切酶、连接酶、T载体等均购自Promege公司，其他试剂购于华美生物工程公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　目的基因克隆及重组　以狂犬病毒全基因及IL-2全基因文库设计特异性引物，以狂犬病毒cDNA和IL-2 cDNA为模板，经PCR扩增，调出目的基因，于T载体中克隆，获得足够量基因片段^［4］。

　　1.2.2　重组基因的构建与表达　将两目的基因经修饰连接后，重组于PBV₂₂₀表达载体中并转化于DH5α受体菌中，得到工程菌。

　　1.2.3　SDS-PAGE、4.5%浓缩胶、15%分离胶　参见文献［5］。

　　1.2.4　表达产物生物学鉴定采用ELISA检测IL-2活性　采用小鼠免疫法检测表达产物的抗原性。

　　2　结果

　　2.1　目的基因PCR引物设计与扩增　设计两对PCR特异性引物，含有酶切位点及启动子的IL-2引物。含有酶切位点及终止子的狂犬病毒N蛋白基因引物。扩增后得到IL-2 (0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)基因片段。结果见图1、图2。

图1　构建IL-2和N蛋白的表达载体

　　Fig.1　Construction of human IL-2 and NP expressing clone

图2　IL-2和狂犬病毒N蛋白扩增产物

　　Fig.2 Matters of IL-2 and rabies virus nucleoprotein gene by PCR

　　Note:1. 0.4 kD IL-2 gene;2. 1.4 kD rabies virus nucleoprotein gene;3.λDNA HindⅢ marker

　　2.2　目的基因构建　将分别获得的IL-2和狂犬病毒N蛋白基因分别连接于T载体中克隆，经特异性酶切后，于PBV₂₂₀表达载体中构建，得到表达载体(PBIRB vetor)，本表达载体有SD序列和PRPL启动子及T₁T₂终止子，在ECORI和BamHI两酶切位点之间有IL-2 RB基因，构建图见图1。构建后基因纯化后鉴定结果见图3。

图3　重组基因鉴定

　　Fig.3　The recombinant gene were identified

　　Note:1.λ DNA HindⅢ marker; 2. 0.4 kD IL-2 gene and 1.4 kD rabies virus nucleoprotein; 3. 1.8 kD recombinant gene

　　2.3　目的基因的表达产物鉴定　目的基因于工程菌中转化后，获得产物经IL-2单抗检测结果见表1。表1结果可见，重组产物具有IL-2活性。表达产物免疫小鼠后，以狂犬病毒标准毒株(CVS)攻击小鼠，小鼠有一定保护力。攻毒途径：脑内0.03 ml，含30个LD₅₀病毒。

表1　重组基因表达产物酶联免疫吸附试验结果

　　Tab.1 The experssion matters of recombinant gene of enzyme linked immnosorbeat assay

Groups			(IL-2 absorb value (OD，			Negtive
	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	1∶32
1	0.235±0.04	0.249±0.05	0.276±0.05	0.172±0.04	0.130±0.01	0.119±0.04
2	0.231±0.03	0.262±0.08	0.312±0.04	0.191±0.07	0.090±0.01	0.101±0.03
3	0.256±0.05	0.200±0.04	0.270±0.05	0.190±0.04	0.070±0.02	0.006±0.01
4	0.224±0.03	0.200±0.04	0.254±0.01	0.212±0.06	0.061±0.03	0.009±0.02

　　3　讨论　　以狂犬病毒及IL-2基因文库设计2对具有特异性酶切位点引物，经PCR扩增后，得到两条特异性基因片段，分别为IL-2(0.4 kD)和狂犬病毒N蛋白(1.4 kD)。两基因于T载体中克隆后，顺利得到重组子。

　　选用PBV₂₂₀表达载体，正向插入目的基因，获得表达型特异基因载体，该载体除基因自身的启动子和终止子外，还具有PRPL强启动子和T₁T₂终止子。于工程菌中表达得到较理想效果。

　　普遍认为狂犬病毒只有外膜的糖蛋白能刺激机体产生中和抗体^［6］，抵抗病毒攻击，而其它成分不产生中和抗体，抗病毒表现极弱。然而N蛋白细胞免疫调节功能，已被许多专家研究证实^［7］。Lutze等用腺病毒表达了狂犬病毒N基因疫苗，免疫小鼠可抵抗病毒攻击^［8］。本研究的重组基因产物具有抵抗病毒能力。

　　IL-2是一种重要的细胞因子，它承担着调节机体免疫网络运行功能，采用IL-2作为提高机体免疫反应的信号，与狂犬病毒N蛋白基因重组，辅佐狂犬病毒N蛋白的抗原性，提高免疫效果。以IL-2作为内源性佐剂提高重组抗原的免疫原性值得深入探讨。

　　作者简介：任政华，女，44岁，博士，主要研究微生物与免疫学；

　　指导教师，刘宝全，男，60岁，教授，博士生导师，主要研究免疫球蛋白的分型及球蛋白亚类分子克隆

　　4　参考文献

　　[1]　Otvos L J,KrivulKa G R，Urge L et al. Comparison of the effects of amino acid substitutions and beta-N-VS.alpha-o-glycosylation on the T cell stimulatory activity and conformation of an epitope on the rabies virus glycoprotein.Biochim Biophys Acta,1995;29(1):55

　　[2] Lodmell D L，Smith J S，Esposito J J et al.Cross-protection of nice against a global spectrum of rabies virus. J Virol,1996;69(8):4957

　　[3] Xiang Z Q，Spitalnik S L，Cheng J et al.Immune responses to nucleic acid vaccine to rabies 　virus.Virology,1995;209(2):569

　　[4]　Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T ed.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1996：674-676

　　[5]　李　蓉.克隆识别.北京：北京医科大学中国协和医科大学出版社，1994：177-182

　　[6]　Ray N B，Ewall L C，Lodemll D L.Nanogram quantities of plasmicl DNA encoding the rabies virus glycoprotein protect mice against lethal rabies virus infection.Vacce,1997;15(8):892

　　[7] Goto H,Minamoto N,Ito H et al. Expression of the nucleoprotein of rabies virus in Escherichia Coli and mapping of antigenic sites.Arch Virol,1995;140(6):1061

　　[8] Lutze W C,Sapp T,Sidhu W et al.In Vitero assessments of the genetic stability of a live recombinant human adenovirus vaccine against rabies.Can J Vet Res,1995;59(2):157

〔收稿1997-01-02　修回1998-12-20〕