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亚急性重型肝炎患者TNF-α和IL-1表达及IL-4对其的调控
中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 临床免疫学
作者：张立煌 孙永良 石裕明 方海林 李敏伟 姚航平 刘克洲
单位：浙江大学附属第一医院传染病研究所，杭州310003
关键词：亚急性重型肝炎；白细胞介素 4；肿瘤坏死因子 α；白细胞介素 1；外周血单个核细胞
摘 要 目的：分析IL-4对亚急性重型肝炎(亚重肝)患者外周血单个核细胞(PBMCs)TNF-α和IL-1的调控作用，评价IL-4在亚重肝治疗中的潜在价值。方法：应用细胞生物学、免疫组化和RT-PCR等方法测定PBMCs TNF-α、IL-1的表达。结果：亚重肝患者PBMCs TNF-α、IL-1表达水平均较正常人显著增高，虽然IL-4 mRNA及蛋白质的表达与正常人比较无显著性差异，但IL-4 mRNA/TNF-α mRNA和IL-4 mRNA/IL-1α mRNA的比值明显降低，IL-4以剂量依赖方式明显抑制LPS诱导的亚重肝患者PBMCs TNF-α、IL-1的表达；与正常人比较，IL-4对亚重肝患者PBMCs的作用效应降低。结论：IL-4对亚重肝PBMCs TNF-α、IL-1的表达均具有明显抑制作用，在亚重肝的治疗上具有潜在的应用价值。
中国图书分类号 R512.62 R392.11
Study on effect of IL-4 on expression of TNF-α and IL-1 from patients with subfulminant hepatitis
ZHANG Li -Huang, SUN Yong -Liang, SHI Yu -Ming et al. Institute of Infectious Diseases, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
Abstract Objective: To study the effect of IL-4 on expression of TNF-α and IL-1 by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with subfulminant hepatitis (SFH) and estimate the potential clinical value of IL-4 in treatment of SFH.Methods:The expression of TNF-α and IL-1 by PBMCs was detected by biological activity assay,immunohistochemical assay and semiquantitative reverse transcriptional polymerase chain reaction (RT-PCR).Results:The expression of TNF-α and IL-1 by PBMCs from patients with SFH were greatly enhanced as compared with that of normal controls. Although there was no difference in expression of IL-4 mRNA/IL-1α mRNA and IL-4 mRNA/TNF-α mRNA in SFH were lower than in normal controls.IL-4 in dose-dependent manner down regulated the LPS-stimulated produced of both TNF-α and IL-1 by PBMCs from patients with SFH. It was also found that the response of PBMCs to IL-4 decreases in SFH as compared with the normal controls.Conclusion:IL-4 seems to be a potent down-regulator of TNF-α and IL-1 and may have a potential role in treatment of SFH.
Keywords Subfulminant hepatitis Interleukin-4 Tumor necrosis factor-α Interleukin-1 Peripheral blood mononuclear cells
白细胞介素4(IL-4)是Th2细胞产生的一种具有多种生物学功能的细胞因子，体内、外实验已证明，其对单核/巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)具有明显的抑制作用［1］，临床应用于感染性休克治疗取得较好的疗效［2］。重型肝炎的发病机理在许多方面与感染性休克相似，均与体内TNF-α和IL-1的异常增高有关［3，4］。为了预测IL-4在重型肝炎临床治疗中的应用价值，本研究观察了亚急性重型肝炎患者PBMCs TNF-α、IL-1和IL-4的表达水平，IL-4对亚重肝患者TNF-α和IL-1的调控作用，结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 亚急性重型肝炎患者12例(男8例，女4例，年龄28～54岁)，诊断标准符合北京1995年全国传染病和寄生虫病学术会议修订的标准。
1.1.2 重组人TNF-α、IL-1、IL-4均为Sigma产品，鼠抗人TNF-α单抗、兔抗人IL-4多抗为Genzyme产品，兔抗人IL-1α多抗为GIBCO产品，RT-PCR试剂盒为PE/cetu产品，ABC免疫组化试剂盒为Vector产品。
1.1.3 TNF-α、IL-1α和IL-4引物由中科院上海细胞生物研究所合成，β-action引物由本所陈智博士惠赠。引物序列为：TNF-α正义链TGAGCACTGAAAGCATGATC，反义链TTATCACTCAGCTCCACGCC；IL-1α正义链GCCAATGACTCAGAGGAAGA，反义链TCTCAGGCATCTCCTTCAGC；IL-4正义链CCTCTGTTCTTCCTGCTAGC，反义链CCGTTTCAGGAATCGGATCA；β-action正义链TTCCAGCCTTCCTTCCTGG，反义链TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT。
1.2 实验方法
1.2.1 外周血PBMCs分离 参照文献［3］方法进行。
1.2.2 TNF-α、IL-1的诱生及测定 于96孔培养板，每孔加入2×106 ml-1的PBMCs悬液200 μl，对照孔只加脂多糖(LPS，1 μg/ml)，处理孔同时加LPS和IL-4，置37℃，5%CO2条件培育18 h，收获上清，-40℃保存。TNF-α和IL-1生物学活性测定参照文献［3］方法进行。另于24孔培养板，每孔加入1×106 ml-1的PBMCs悬液1 ml，同上设对照孔和处理孔，置37℃，5%CO2条件培育4 h，参照Chomezynski等方法抽提总RNA［5］。
1.2.3 单核细胞内TNF-α和IL-1α的诱生和检测 取1.2.2中部分细胞继续培养4 h，用细胞涂片装置制片，细胞内TNF-α和IL-1α的检测采用ABC免疫组化法，参照试剂盒说明书操作。
1.2.4 IL-4的诱生及检测 于96孔培养板，每孔加入1×106 ml-1的细胞悬液200 μg，用PHA(200 μg/ml)诱生，置37℃，5%CO2条件下培养18 h，收获上清。IL-4测定采用双夹心ELISA法，参照试剂盒(Genzyme产品)说明书操作。另于24孔培养板，每孔加入1×106 ml-1的细胞悬液1 ml，用PHA(200 μg/ml)诱生，置37℃，5%CO2条件下培养4 h，总RNA的抽提同上。
1.2.5 RT-PCR 参照试剂盒说明书进行。取10 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙啶染色，紫外光检测仪观察结果，并照相，用光密度扫描仪对底片产物条带扫描，计算目的产物与β-action产物的比值。
1.2.6 统计学处理 每份标本设3个复孔，取平均值，组间均数比较采用双侧t检验。
2 结果
2.1 亚重肝患者PBMCs TNF-α、IL-1和IL-4的表达水平 亚重肝患者PBMCs TNF-α、IL-1的生物活性、单核细胞细胞因子阳性率及其mRNA水平均较正常人明显增高(P＜0.05)；IL-4及其mRNA水平与正常人比较无显著性差异，但IL-4 mRNA/TNF-α mRNA比值和IL-4 mRNA/IL-1α mRNA比值明显低于正常人(P＜0.05)。见表1、表2。
2.2 IL-4对PBMCs TNF-α、IL-1表达的影响 选择3例正常人和3例亚重肝患者，观察IL-4对LPS刺激的PBMCs TNF-α和IL-1表达的影响。正常人IL-4为10 U/ml时即对TNF-α和IL-1产生较明显的抑制效应，100 U/ml时接近最大抑制效应。而亚重肝患者IL-4为100 U/ml时对PBMCs TNF-α和IL-1的表达开始产生抑制效应，为1 000 U/ml时抑制作用接近最大，剂量反应曲线明显右移(结果省略)。
表1 重型肝炎患者PBMCs TNF-α和IL-1α的表达水平
Tab.1 The expression of TNF-α and IL-1α by PBMCs from SFH patients
| Test | TNF-α | IL-1 | ||
| SFH(n=12) | Normal(n=10) | SFH(n=12) | Normal(n=10) | |
| Biological activity(U/ml) | 67.87±24.112) | 13.70±3.26 | 4 029.30±1 146.402) | 1 432.10±517.50 |
| Positive rate in monocytes(%) | 38.96±3.351) | 31.09±2.70 | 29.40±3.341) | 20.03±1.81 |
| mRNA( ratio to β-action) | 3.17±1.322) | 1.35±0.40 | 2.25±0.582) | 1.09±0.34 |
note:vs normal control,1)P＜0.05，2)P＜0.01
表2 重型肝炎患者PBMCs IL-4及IL-4 mRNA的表达水平
Tab.2 The levels of IL-4 and IL-4 mRNA by PBMCs from SFH patients
| Group | n | IL-4
(pg/ml) |
IL-4 mRNA
(ratio to β-action) |
IL-4 mRNA
/TNF-α mRNA |
IL-4 mRNA
/IL-1α mRNA |
| Normal | 10 | 28.86±19.32 | 1.99±1.10 | 1.54±0.62 | 2.18±1.07 |
| SFH | 12 | 26.32±17.78 | 2.28±1.89 | 0.83±0.562) | 1.08±0.841) |
note:vs normal control,1)P＜0.05；2)P＜0.012.3 IL-4为1 000 U/ml浓度时处理亚重肝患者PBMCs的结果 IL-4对亚重肝患者TNF-α和IL-1的产生具有明显的抑制作用(P＜0.01)，见表3。
表3 IL-4对亚重肝患者PBMCs TNF-α和IL-1表达的影响
Tab.3 The effects of IL-4 on TNF-α and IL-1 expression by PBMCs from SFH patients
| Test | TNF-α | IL-1 | ||
| LPS | LPS+IL-4 | LPS | LPS+IL-4 | |
| Biological activity( U/ml) | 67.87±24.11 | 26.12±8.572) | 4 029.30±1 146.40 | 1 346.00±605.702) |
| Positive rate in monocytes(%) | 38.96±3.23 | 23.54±4.312) | 29.40±3.34 | 17.27±2.572) |
| RNA(ratio to β-actoin) | 3.17±1.32 | 1.38±0.381) | 2.25±0.58 | 1.22±0.481) |
note：vs LPS+IL-4, 1)P＜0.05；2)P＜0.013 讨论
我们曾报道，重型病毒性肝炎患者TNF-α和IL-1的表达水平较正常人显著增高，是重型肝炎发病机理的重要因素［3］。本实验结果表明亚急性重型肝炎患者PBMCs TNF-α和IL-1的生物学活性及其mRNA和蛋白质表达水平均较正常人明显增高，支持上述观点。动物实验已证实，如预先用抗TNF-α和IL-1单克隆抗体阻断TNF-α和IL-1的作用，则可防止或减轻这两种细胞因子介导的肝脏损伤［6］。因此，降低重型肝炎患者TNF-α和IL-1的过多分泌，有望缓解肝脏的损伤。
任红等报道重型肝炎患者PBMCs诱生的IL-4活性与正常人无差异［7］，本实验结果也证实重型肝炎患者IL-4的mRNA表达水平与正常人比较无明显差异。但IL-4 mRNA/TNF-α mRNA和IL-4 mRNA/IL-1α mRNA比值均明显低于正常人，提示患者体内IL-4水平相对低下。如适当增加IL-4，对于抑制患者异常分泌的TNF-α和IL-1可能有临床意义。
比较IL-4对正常人和重型肝炎患者PBMCs TNF-α和IL-1的调控作用，结果表明，较低剂量的IL-4对正常人PBMCs TNF-α和IL-1的产生即具有明显的抑制效应。正常人IL-4为100 U/ml时对TNF-α和IL-1的抑制效应己接近最大。而在重型肝炎患者，需要1 000 U/ml的浓度才达到相似的抑制效应，两者的剂量相差10倍以上，反应曲线明显右移，提示重型肝炎患者PBMCs对IL-4的应答性明显低于正常人，因而IL-4不能有效地发挥抑制TNF-α和IL-1分泌的作用，可能是重型肝炎患者体内IL-4水平正常，而TNF-α和IL-1水平明显增高的原因之一。IL-4对亚重肝患者TNF-α和 IL-1抑制呈剂量依赖方式。但由于IL-4是一种具有多种生物学活性的细胞因子，大剂量使用尚可产生一系列副作用，如 Ⅰ 型超敏反应和机体免疫功能抑制。因此，进一步开展重型肝炎患者PBMCs对IL-4应答性的研究，设法提高PBMCs对IL-4的应答性可能具有重要的临床意义。
本课题获国家自然科学基金(39300122)，浙江省自然科学基金(394190)资助
作者简介：张立煌，男，41岁，副研究员，硕士生导师，主要研究分子免疫及其与病毒性肝炎、肝纤维化的关系；
孙永良，男，34岁，副研究员，硕士生导师，主要研究分子免疫学及感染免疫学
4 参考文献
1 Hart P H, Vitti G F, Burgess D R et al. Potential antiinflammatory effects of interleukin 4: suppression of human monocyte tumor necrosis factor α， interleukin-1 and prostaglandin E2. Pro Natl Acad Sci USA, 1989； 86:3803
2 Dinarello C, Dickler H, MCS Weegan E et al. IL-4: the next septic shock treatment Biotechnology News, 1992; 12:5
3 孙永良，张立煌，方海林et al. 病毒性肝炎患者IL-1、IL-6和TNF-α活性的控测.中华微生物学和免疫学杂志，1994；14(3)：187
4 Muto Y, Nouri-Aria K T, Meager A et al. Enhanced tumor necrosis factor α and interleukin-1 in futminant hepatic failure. Lancet, 1988； 2:72
5 Chomezynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidiniun, thiocyanate-phenol-chlorform extraction. Anal Biochem, 1987; 162:156
6 Liu P, Ohnishi H, Maoriwaki H et al. Enhanced tumor necrosis factor and interleukin-1 in an experimental liver cell necrosis / fatal hepatitis in mice. Gastroenterol, 1990; 25(2): 339
7 任 红,张定凤，张学华 et al. 乙型肝炎患者白细胞介素2、4、6的活性比较.中华传染病杂志，1991；9(1)：36
〔收稿1998-01-15 修回1998-05-14〕