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L7212白血病小鼠IL-2活性、IL-2 mRNA表达及复方中药清毒饮对其影响的研究①
中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 中医中药与免疫
作者：李振波 丘和明 张 萍
单位：李振波(广州中医药大学第一附属医院内科 广州 510405)；丘和明(广州中医药大学第一附属医院内科 广州 510405)；张 萍(北京医科大学血液学研究所分子生物学实验室 北京 100044)
关键词：实验性白血病；中医药疗法；IL-2；IL-2 mRNA；小鼠
摘 要：目的：探讨L7212白血病小鼠及其受体鼠——近交系615小鼠IL-2活性和IL-2 mRNA的表达及复方中药清毒饮对其影响。方法：采用IL-2依赖株CTLL-2及细胞原位杂交的方法检测了由ConA诱导的脾细胞培养上清中IL-2活性及脾细胞IL-2 mRNA表达。结果：发现由ConA诱导的L7212的白血病小鼠脾细胞培养上清中IL-2活性明显低于615小鼠，P＜0.05；其脾细胞中IL-2 mRNA表达也明显低于615小鼠，P＜0.01。清毒饮显著提高ConA诱导的L7212白血病小鼠脾细胞培养上清中的IL-2活性，P＜0.001，并能显著提高其mRNA表达水平，P＜0.001。结论：清毒饮可以作为生物反应调节剂用于白血病的临床治疗。
分类号：R733.7 R392.11
Interleukin-2 activity and its mRNA expression in L7212 leukemia mice and the affection of the recipe of Qingduyin
LI Zhen-Bo
Guangzhou University of Traditional,Chinese Medicine，Guangzhou 510405
QIU He-Ming
Guangzhou University of Traditional,Chinese Medicine，Guangzhou 510405
ZHANG Ping
Guangzhou University of Traditional,Chinese Medicine，Guangzhou 510405
Abstract：Objective In order to observe interleukin-2(IL-2) activity and IL-2 mRNA expression in L7212 leukemia mice and the influence of the recipe of Qing du yin on them.Methods: The activity of IL-2 has been tested with IL-2-dependent strain.CTLL-2,and its mRNA expression with cell in situ hybridization.Results Interleukin-2 activity in supernate of cultured spleen cell induced by concanavalin A and interleukin-2 mRNA expression in spleen cells in L7212 are lower than those in the receptor mice of 615. The recipe of Qing du yin can improve the activity of IL-2 through promoting its mRNA expression.Conclusion:There are no IL-2 hypersecretion in L7212 mice,the recipe of Qing du yin can treat leukemia in clinic as biological response modulatlor
Key words：Experimental leukemia Traditional Chinese drug therapy Interleukin-2 Interleukin-2 mRNA Mice▲
本研究以L7212白血病小鼠为模型，研究了其IL-2活性及其mRNA的表达，并观察了清热解毒抗白血病复方清毒饮对其IL-2活性、IL-2 mRNA表达的影响，以了解IL-2在L7212白血病小鼠及其受体615小鼠中的活性差异，以及清毒饮作为生物反应调节剂在L7212白血病小鼠中对IL-2活性的调节作用，并从mRNA水平对其机理进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料 近交系615小鼠，雄性，体重18～22 g。由中国医学科学院实验动物中心提供；L7212白血病细胞株，由中国医学科学院血液学研究所病理室提供；中药清毒饮，由七叶一枝花、白花蛇舌草、胡黄连、大青叶、山慈菇、法半夏、竹茹、莪术、制大黄、生地、仙鹤草、田七组成。制剂由广州中医药大学第一附属医院临床药理研究所制剂室以水提醇沉淀法制备，终浓度为200%(每100 ml药液含饮片200 g)。制剂，刀豆素A(Concanvalin A，ConA)为美国Sigma产品。标准重组人白细胞介素2(Recombine human IL-2rhIL-2)由北京医科大学分子免疫室提供。IL-2依赖细胞株CTLL-2，由北京医科大学分子免疫室提供。IL-2 cDNA为PCR产物，480 bp由北京医科大学分子免疫室马大龙教授赠送。十二烷基磺酸钠(SDS)、RNA酶(RNase)、蛋白酶K、随机引物、DNA聚合酶大片段(Klenow)和dNTP(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)均购自华美生物工程公司。生物素标记的脱氧嘧啶(Biotin-21-dUTP)购自原平生物工程公司。链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶结合物(SA-AP)、硝基四氮唑蓝液(NBT)、5溴-4氯-3吲哚磷酸溶液(BCIP)为美国BRS公司产品。阻断液：50 mg/ml脱脂奶粉，100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，150 mmol/L NaCl，0.2 mg/ml叠氮钠。
1.2 方法 L7212白血病小鼠模型的建立，参照褚建新法［3］；L7212白血病细胞接种量及接种时间。以溶血空斑(PFC)试验作预试验发现615鼠接种L7212白血病细胞1×105/只，5 d后PFC比正常615鼠减少约一半，故采用此量用于实验。分组及用药：取30只615小鼠，10只作为对照组，20只接种L7212白血病细胞1×105/只，其中10只为清毒饮组，另10只为L7212组。清毒饮组以清毒饮灌胃，对照组和L7212组以生理盐水灌胃，每日灌0.3 ml/只，连续灌5 d，做以下实验。IL-2活性测定参照钱玉昆法［4］。
1.3 IL-2 mRNA表达
1.3.1 取小鼠脾细胞悬液，涂片、烤片、固定，放入75%乙醇中，-20℃冰箱贮存标本。
1.3.2 随机引物法以Bioton-21-dUTP 标记IL-2 cDNA探针，并做探针灵敏度检测，此法检测探针灵敏度可达0.2 pg。
1.3.3 细胞原位杂交(cDNA-mRNA杂交)，用链霉亲和素-碱性磷酸酶检测系统做细胞涂片cDNA-mRNA原位杂交［5］。①取-20℃ 75%乙醇中保存的标本，用含0.03%TritonX-100的PBS洗片2次，每次2 mim。②取10 μg/ml蛋白酶K 50 μl于37℃消化10 min，再用DEPC处理的生理盐水洗涤2次，每次2 min。③4%多聚甲醛-戊二醛固定1 mim，用DEPC处理的生理盐水洗涤两次，每次2 min。④50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水各3 min，室温晾干。⑤取25 μl Bioton-21-dUTP标记的IL-2 cDNA探针与31 μl 20%硫酸葡聚糖甲酰胺溶液(w/v)混合均匀。⑥沸水溶解链变性5 min，立即放入冰浴中冷却10 min。⑦加入RVC(氧钒核苷复合物200 mmol/L)混匀，滴于载玻片上加盖。⑧次日去除盖片，用0.2×SSC洗去杂交液后，阻断液室温作用15 min。⑨以SA-AP稀释液5 ml加SA-AP 1 μl混匀，每片加50 μl。37℃保温30 min。⑩以2 ml底物缓冲液加入9 μl NBT，7 μl BCIP混匀，每片加50 μl，保温1 h。B11以三蒸水冲洗干净后，光镜下观察。cDNA-mRNA杂交信号为紫红色颗粒或絮状物定位于胞浆。
阴性对照：杂交前细胞涂片经RNase处理或用2×SSC代替目的探针。杂交信号的定量分析：用LEICAQ550IW图像分析仪对原位杂交标本进行扫描，随机选取10个细胞，计算出信号的积分光密度值(IOD)，以表示IL-2 mRNA的表达强度，结果进行计量资料的t 检验。
2 结果
由ConA诱导的L7212的白血病小鼠脾细胞培养上清中IL-2活性明显低于615鼠，P＜0.05；其脾细胞中IL-2 mRNA也明显低于615小鼠，P＜0.01。清热解毒中药清毒饮能显著提高ConA诱导的L7212白血病小鼠脾细胞培养上清中的IL-2活性，P＜0.001，并能显著提高其mRNA表达水平，P＜0.001。
表1 清毒饮对L7212白血病小鼠IL-2及其mRNA表达的影响
Tab.1 Influence of Qingduyin on IL-2 and IL-2 mRNA expression of L7212 leukemia mice
| IL-2(U/ml) | IL-2 mRNA(OD value) | |
| Qingduyin group | 48.75±2.561) | 0.4340±0.04381) |
| L7212 | 26.01±8.722) | 0.2580±0.02443) |
| 615 | 36.67±0.11 | 0.3320±0.0274 |
Note:n=10；compared with L7212 leukemia mice group;1)P＜0.001;compared with 615 mice group ,2)P＜0.05,3)P＜0.01
3 讨论
IL-2主要是由T细胞产生的15 kD的糖蛋白，并作用于T细胞，促使T细胞增殖，因此其对T细胞的作用主要是通过自分泌来实现的。IL-2是机体内最主要、最强有力的T细胞生长因子。IL-2可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性，如NK、CTL、LAK和TIL等细胞，这些细胞在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫方面至关重要。
目前IL-2在AL中的作用还未有定论。Foa等报道IL-2在体内、体外不仅不促进白病细胞的增殖，而且显示对急性髓细胞白血病(AML)有抑制作用［6］，而Macdonald和Carron等指出，IL-2可以诱发某些AML细胞增殖，也可刺激成人T淋巴细胞白血病及淋巴瘤白血病细胞生长［7-9］。
由于目前的研究对IL-2在白血病中的作用尚无定论。在AL白血病中有无IL-2的自分泌增加；IL-2用于AL是有效抑制或促进白血病细胞增殖尚无定论。
L7212白血病小鼠是由近交系数615小鼠自发性白血病在同系成年小鼠中移植，经连续传代而建立的一株幼稚T淋巴细胞白血病小鼠模型［3］，多年来被广泛用于抗白血病药物的筛选研究中［10］。本研究发现L7212白血病小鼠由ConA诱导的其脾细胞培养上清中IL-2及IL-2 mRNA表达均明显低于其受体小鼠，近交系615小鼠，说明L7212白血病小鼠无IL-2自分泌增加，相反抗白血病中药复方清毒饮能增加IL-2活性及IL-2 mRNA。
清毒饮由七叶一枝花、白花蛇舌草、山慈菇、法半夏、大青叶、大黄、生地、仙鹤草、田七组成。主要作用为清热解毒、化痰散结、凉血活血止血，在临床上配合化疗治疗AL具有一定的疗效。实验证实，其能延长L7212白血病小鼠生存期，生命延长可达到31.61%，作为有效的治疗方剂，其能提高IL-2的活性及IL-2 mRNA的表达，说明L7212白血病小鼠无IL-2自分泌增加，相反抗白血病中药复方清毒饮能增加IL-2及IL-2 mRNA，这可能是其抗白血病机理之一，提示清毒饮可作为一种有效的生物反应调节剂应用于临床。
mRNA是基因与表达产物之间的桥梁，基因活化的直接结果是mRNA转录增加，而且蛋白质的合成有赖于mRNA的翻译，即一种蛋白质分子表达的调控，从大体上来讲，可分为转录水平和翻译水平。从IL-2生物活性分析来看，清毒饮可在蛋白质水平上促进IL-2的分泌量；而细胞原位杂交的结果显示清毒饮可在转录水平上影响IL-2的产生，至于清毒饮是影响mRNA的稳定性，还是加快了基因转录的速率，尚有待进一步研究。■
①本课题由国家中医药管理局资助，课题号为95C041
作者简介：丘和明，男，63岁，教授，博士生导师；
李振波，女，34岁，博士，主治医师；
张 萍，女，44岁，副研究员
参考文献：
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［4］钱玉昆，殷金珠.实用免疫学新技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994：49
［5］宋玉华，林永敏，李 牧et al.应用非放射性标记探针原位杂交研究人白血病细胞基因表达.中华血液学杂志，1993；14(2)：74
［6］Foa R,Caretto M,Fierro M et al. Interleukin-2 does not promote the in vitro and in vivo proliferation and growth of human acute leukemia cells of myeloid and lymphoid origin.Br J Haematol，1990;75:34
［7］macdonald D,Jing Y Z， Swirsky T et al.Acute myeloid leukemia relapsing following interleukin-2 treatment express the alpha chain of the interleukin-2 receptor.Br J Heamatol,1991;77:43
［8］Carron J A ，Cawley J C. IL-2 and myelopoiesis:IL-2 induces blast cell proliferation in some cases of acute myeloid leukemia.Br J Haematol,1989;73:168
［9］Matsushita K,Fujiwara H,Matsumoto T et al. Interleukin-2-mediated growth of leukemia cells in lymph nodes of patients with acute-T-cell leukemia/lymphoma.Leuk Res，1996;20(2):135
［10］褚建新，李肇玫.615近交系小鼠及其在实验肿瘤研究中的应用.北京：人民卫生出版社，1989：104-105
收稿日期：1998-11-02
修回日期：1998-12-12