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脑不对称 Balb/c 小鼠血浆IL-1β、IL-6及皮质酮水平变化①
中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 神经内分泌与免疫
作者：高明霞 李康生 董菁 P.J.Neveu
单位：高明霞（汕头大学医学院微生物学及免疫学教研室，汕头515031）；李康生（汕头大学医学院微生物学及免疫学教研室，汕头515031）；董 菁（汕头大学医学院微生物学及免疫学教研室，汕头515031）；P.J.Neveu（汕头大学医学院微生物学及免疫学教研室，汕头515031）
关键词：脑不对称性；神经免疫内分泌；细胞因子
摘 要：目的：研究脑不对称性对细胞因子和HPA轴的影响。方法：用伸爪取食法将小鼠区分为左利、右利、双利动物，LPS分别刺激2、4 h后取血浆用ELISA法检测IL-1β、IL-6、放免法测定血浆皮质酮含量。结果：左利组血浆IL-1β高于右利组，左利、右利组IL-1β均低于双利组。左利、右利组血浆皮质酮水平低于双利组。LPS刺激后左利组IL-1β高于右利组，双利组亦高于右利组；左利、右利组血浆IL-6水平则均低于双利组。结论：脑不对称性对神经免疫内分泌网络有影响，左利者免疫紊乱发生率高可能与此有关。
分类号：R392.1
The levels of plasma IL-1β，IL-6,corticosterone of Balb/c mice with lateralization
GAO Ming-Xia
Department of Microbiology and Immunology,Shantou University Medical College, Shantou 515031
LI Kang-Sheng
Department of Microbiology and Immunology,Shantou University Medical College, Shantou 515031
DONG Jing
Department of Microbiology and Immunology,Shantou University Medical College, Shantou 515031
Abstract：Objective: To study the relationship between cytokines，HPA axis and lateralization.Methods：By using paw preference test,right-pawed ,left-pawed,ambidextrous mice model were established. ELISA kits and radioimmunoassay were used for detection of plasma levels of cytokines and corticosterone.Results:In untreated normal Balb/c mice ,left-pawed mice had a higher IL-1β level than right-pawed mice (P＜0.05),while IL-1β of ambidextrous was the highest among them; There was no difference observed between the three groups in plasma levels of IL-6; As for plasma levels of corticosterone in untreated mice, left-pawed and right-pawed mice were both lower than ambidextrous mice.In LPS treated mice, plasma levels of IL-1β were higher in left-pawed mice than in right-pawed and ambidextrous mice, and right-pawed mice was lower than ambidextrous; The plasma levels of IL-6 were lower in left-pawed and right-pawed mice than in ambidextrous(P＜0.01). The plasma levels of corticosterone were almost the same among the three groups after the injection of LPS. Conclusion: Lateralization could influence cytokine levels and HPA axis in mice.
Key words：Brain lateralization Neuroimmunoendocrine Cytokines ▲
机体在发育过程中形成了脑不对称性（Brain lateralization）。脑不对称性是一个普遍的生物学现象，对机体许多功能有明显影响。因手功能的不对称性是脑不对称性最明显的表现，研究上常按手功能不对称性的不同将人群区别为惯用左手者（左利，Left -hander，LH），惯用右手者（右利，Right-hander，RH），无明显惯用手者（双利，Ambidextrous-hander,AH）。自从80年代Geschwind报道了左利人群有较高的免疫紊乱发生率后，研究者运用伸爪取食法区分出左利和右利动物, 深入研究脑不对称性对免疫功能影响及可能的机制。正常状况下左利和右利动物T细胞、Mφ细胞、NK细胞活性不同，用LPS腹腔注射动物模拟细菌感染和炎症性疾病的情况下，左利和右利动物血浆ACTH和皮质酮（Corticosterone，CS）上升幅度亦与脑不对称性有关［1］。神经免疫内分泌网络在免疫紊乱发病机制中起的作用，越来越受重视，IL-1、IL-6和CS是其中的重要因子。为探讨左利者免疫紊乱发生率高的原因，有必要研究脑不对称性对神经免疫内分泌网络的影响。为此，本文研究了脑不对称性Balb/c小鼠正常状况及受LPS 刺激后血浆IL-1β、IL-6和CS的水平变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Balb/c健康小鼠，雌性，4周龄，由中山医科大学实验动物中心供应。在本实验室喂养，5只/笼，自由饮水取食，每天保持12 h明暗环境，行为测试及最后的实验均在上午进行。
1.2 左利和右利动物模型的建立 动物适应环境1 w后经伸爪取食法区分为左利、右利和双利3组。方法如下：小鼠禁食12～18 h后，置于一特制盒内，盒子体积为4.5 cm×4.5 cm×6.0 cm，前壁中央连有一小管可供放入小饲料块，以小饲料块逗引小鼠伸爪取食，观察其50次伸爪取食中伸右爪次数，记为右利分（Right paw entry,RPE)。2 w内共测试4次，第1次作为训练，不记录，将余下3次右利分平均，0～20分为左利鼠(Left-pawed mice)，21～29分为双利鼠(Ambidextrous mice)，30～50分为右利鼠(Right-pawed mice)［2］。区分后1 w，实验组每只小鼠以LPS(Escherichia coli serotype 026:B6, Sigma) 5 μg/ 0.5 ml无菌生理盐水，正常对照组用0.5 ml无菌生理盐水（NS），腹腔注射。注射后2 h和4 h分别快速断头杀鼠。用置于冰上并肝素化的试管收集小鼠血液，3 000 r/min离心15 min后取血浆，分装后置于－30℃保存待测。
1.3 血浆IL-1β和IL-6检测 用ELISA法检测，使用由深圳晶美公司提供的ENDONGEN公司生产的小鼠IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒。按说明书使用，A值用SPSS软件绘出标准曲线，计算各样本的值。
1.4 血浆CS检测 肝素抗凝血浆10 μl加无水乙醇240 μl 于Eppendorf管，振荡混旋10 s，10 000 r/min 离心10 min，取上清50 μl入一小玻璃试管，每个样品设2管，40℃，15 min真空离心干燥，即为制备的样品管。同时设已知CS含量的质控管，用3H-CS、CS结合蛋白进行放免测定。
1.5 统计方法 用SPSS和EXCEL软件对各组血浆IL-1β、IL-6、CS水平进行单因素方差分析（ANOVA）。
2 结果
2.1 Balb/c 小鼠脑不对称性分布模式（图1） 左利小鼠28只（RPE在0～20之间），右利小鼠30只（RPE在30～50之间），双利小鼠18只（RPE在21～29之间）。左利小鼠的RPE主要在15～20间,右利小鼠的RPE在35～40间。
图1 Balb/c雌性小鼠RPE(Right paw entry)分布
Fig.1 Distribution of paw preference in the population of Balb/c female mice.Paw preference is represented as the RPE score
2.2 正常对照组血浆IL-1β和IL-6水平 未注射LPS的正常对照组血浆IL-1β水平测定结果表明（图2），左利组显著高于右利组(P＜0.05)，双利组显著高于左利、右利组(P＜0.05)。其血浆IL-1β水平依次为双利组＞左利组＞右利组。血浆IL-6 如图3所示，正常对照各组之间血浆IL-6水平依次为右利＞双利＞左利，但均无统计学意义。
图2 脑不对称Balb/c小鼠血浆IL-1β水平
Fig.2 Plasma levels of IL-1β in right-pawed,left-pawed and ambidextrous Balb/c mice
2.3 LPS注射后血浆IL-1β和IL-6水平变化 血浆IL-1β 如图2所示，LPS刺激后2 h，左利组显著高于右利组（P＜0.05），双利组亦显著高于右利组（P＜0.05），左利与双利组间无明显差异；刺激后4 h，左利组和双利组仍然显著高于右利组（P＜0.05）。左利组LPS刺激4 h后较2 h有所上升，而右利组和双利组IL-1β均较2 h组下降。LPS刺激后，左利组上升幅度最大，约为5倍(2 h)和7倍(4 h)，右利组次之，约2.4倍(2 h)和2.0倍(4 h)，双利组约1.5倍(2 h)和1.8倍(2 h)。由此可认为左利组对LPS刺激引起的IL-1β上升最敏感。血浆IL-6水平如图3所示，LPS刺激后2 h，左利组上升幅度约为6倍，右利组上升幅度约为7倍，双利组升高了约18倍，显著高于左利组和右利组(P＜0.01)， 双利组对LPS刺激引起的IL-6上升最敏感。LPS刺激后4 h，左利、右利和双利3组间IL-6无明显差异。与LPS刺激后2 h相比，左利、右利和双利3组IL-6在刺激后4 h均显著下降（P＜0.05）。
图3 脑不对称Balb/c小鼠血浆IL-6水平
Fig.3 Plasma levels of IL-6 in right-pawed,left-pawed and ambidextrous Balb/c mice
2.4 LPS注射后血浆CS水平变化 见图4，未注射LPS正常对照双利组血浆CS水平显著高于左利和右利组（P＜0.05），左利组血浆CS水平亦高于右利组，但两组间差别无统计学意义。LPS刺激2 h后，左利、右利和双利3组血浆CS水平均明显升高(P＜0.05),但3组间血浆CS水平无明显差别。
图4 脑不对称Balb/c小鼠血浆皮质酮水平
Fig.4 Plasma levels of corticosteron in right-pawed,left-pawed and ambidextrous Balb/c mice
3 讨论
不同种系的小鼠脑不对称分布模式并不相同： C57BL/6为U形分布，即左利和右利小鼠所占比例大，双利小鼠仅少量；C3H小鼠脑不对称性呈正态分布； Balb/c小鼠脑不对称分布的模式尚无文献报道，我们的实验结果显示，Balb/c小鼠左利和右利鼠占了近80%，而双利小鼠较少。其分布模式与C57BL/6小鼠较接近。而其中左利和右利鼠数量大致相同，这与文献报道相符［1］。
Cabib报道伸爪取食法区分出的脑不对称性反映了动物脑内神经递质的不对称性，右旋多巴胺和总多巴胺的比值与RPE正相关。亦有其它实验证明了脑内单胺的分布在左利动物和右利动物间是不同的。因此可认为伸爪取食法区分出的脑不对称性对免疫系统的影响能反映脑对免疫系统的影响［2］。
脑不对称性可在分子水平上影响免疫功能。 Geschwind等认为脑的不对称性形成过程中，免疫系统也受到影响，具有了不对称性，这导致了左利动物和右利动物免疫功能有所不同。免疫细胞的功能确实受脑不对称性因素的影响：左利小鼠有更高的T细胞活化率，自身抗体的产生亦在左利组更早出现［1］。在我们的实验中，未受LPS刺激的正常Balb/c小鼠群中左利鼠血浆IL-1水平明显高于右利小鼠，这提示作为免疫系统重要组成部分的免疫分子也受左右利因素的影响。另一方面，IL-6在左利、右利及双利3组小鼠中没有差别，说明了不同的免疫分子受脑不对称性因素影响不一样。Neveu亦认为不同免疫指标受脑不对称性的影响不一样：T细胞活化在左利鼠高，NK细胞功能在右利鼠更强，B细胞功能则无差别［1］。
IL-1β、IL-6是神经免疫内分泌网络中起重要作用的多功能分子。Balb/c小鼠受LPS刺激后，与右利小鼠相比，左利小鼠血浆IL-1β水平更高，上升幅度更大，其血浆IL-1高峰期时间延长，在刺激4 h后仍呈上升趋势。另一方面，LPS刺激后左利小鼠血浆IL-6水平则低于右利组。在正常状况和LPS刺激下IL-1β、IL-6水平与脑不对称性有关，这说明了左右利小鼠的神经免疫内分泌功能活动不一致。左利者受刺激后IL-1β呈大幅度、长时期升高，这可能与左利者免疫紊乱发生率高有关。Bryden报道特应性变态反应、哮喘、溃疡性结肠炎与左利成正相关［3］。近来的研究表明，这3种疾病，尤其是变态反应、哮喘与精神因素关系密切，有人认为它们是应激反应性疾病（Stress-induced disease）［4］。临床观察和实验研究都显示IL-1β可能是这3种疾病，尤其是变态反应和哮喘的重要致病因素之一［5］。在应激情况下，豚鼠发生哮喘可能性增加，这可能是因为应激组IL-1β升高，而IL-1β增加可导致ICAM水平上升，参与哮喘的发生［6］。我们的结果显示左利组IL-1β高于右利组，且对LPS的敏感性高于右利和双利，这可能是左利者哮喘发病率较高的原因之一。
脑不对称性对免疫的影响受遗传因素限制。Neveu等报道C3H/HeN小鼠未受LPS刺激时左利组血浆皮质酮较双利组高（有统计学意义），IL-6在各组间无差别，刺激后皮质酮和IL-6在各组间均无明显差别（IL-6的资料未发表）［7］。我们的结果表明未受刺激的Balb/c小鼠血浆皮质酮水平双利组明显高于左利和右利组，IL-6水平无差别；LPS刺激后，血浆皮质酮无差别，IL-6在双利组明显高于左利和右利组。结果不一致可能与所选小鼠种系不同有关。Neveu报道NK细胞活性在C3H/He小鼠为右利高于左利，而C3H/OuJIco则为左利高于右利，认为种系因素在脑不对称性对免疫的作用中有一定影响 ［8］。并且有资料表明Balb/c系小鼠与C3H/HeN小鼠产生细胞因子状况不一致： 在绿脓假单胞杆菌、利什曼原虫、念珠菌感染中Balb/c小鼠产生的IL-4高于C3H/HeN小鼠，而IFN-γ则低于C3H/HeN小鼠，认为Balb/c小鼠是TH2反应小鼠，C3H/HeN小鼠为TH1反应小鼠［9］。
本文初步揭示了脑不对称性可在分子水平上影响免疫系统和神经免疫内分泌网络。由于脑不对称性对免疫功能的影响与神经系统、内分泌系统、免疫系统之间复杂的相互作用有关，脑不对称性与神经免疫内分泌之间的关系及生物学意义尚有待进一步阐明。■
①中法先进研究计划合作项目 （PRA B97-03）
②法国INSERM U394
作者简介：高明霞，女，24岁，硕士研究生；
指导教师，李康生，男，45岁,博士，副教授，硕士生导师，主要从事神经免疫研究
参考文献：
［1］Neveu P J.Lateralization and stress responses in mice: interindividual differences in the association of brain, neuroendocrine,and immune responses. Behav Genetic, 1996;26:373
［2］Cabib S,D amato F R,Neveu P J et al. Paw preference and brain dopamine asymmetries. Neuroscience, 1995; 64(2):427
［3］Bryden M P, McManus I C,Bulman-Fleming M B et al. Evaluation the empirical support for the Geschwind-Behan-Galabuda model of cerebral lateralization.Brain-Cogn,1994; 26(2):103
［4］Rosenwasser L J .Biologic activites of IL-1β and its role in human disease.J Allergy Clin Immunol,1998;102(3):344
［5］Chihara J .Stress and Immunoallergy.Rinsho Byori, 1998; 46(6):587
［6］Okada S,Inone H,Asano M et al. Adjuvant effect of interleukin-1 on the development of late asthmatic response in guinea pigs.Int Arch Allergy Immunol, 1993;100(2):164
［7］Neveu P J, Moya S .In the mouse ,the corticoid stress response depends on lateralization.Brain Research, 1997;749:344
［8］Neveu P J ,Betancur C, Vitiello S et al. Sex-dependent association between immune functions and paw preference in two substrains of C3H mice. Brain Research， 1991; 559:347
［9］Mouser C,Johansen H K,Song Z H et al.Chronic Pseudomonas avruginosa lung infection is more severe in Th2 responding Balb/c mice compared to Th1 responding C3H/HeN mice.APMIS,1997;105:838
收稿日期：1999-06-25
修回日期：1999-11-01