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IL-2-preS融合蛋白表达质粒的基因枪DNA免疫研究
中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：沈肖方 马大龙 白惠卿 李建远 陈章国
单位：沈肖方（北京医科大学免疫学系， 北京 100083）；马大龙（北京医科大学免疫学系， 北京 100083）；白惠卿（北京医科大学免疫学系， 北京 100083）；陈章国（北京医科大学免疫学系， 北京 100083）
关键词：IL-2-preS；基因枪；DNA免疫；抗体
摘 要 目的：观察基因枪肌肉注射IL-2-preS融合蛋白表达质粒(pCWIIP)的基因免疫效率，为乙型肝炎基因免疫研究提供基础。方法： 设 基因枪肌肉注射组和正常肌肉注射组，分别用pCWIIP质粒及对照质粒pCIIP-2和pCI免疫Bal b/c小鼠，免疫后第4天，取肌肉组织通过免疫组化观察IL-2-preS在肌肉中的表达；另设 基因枪、正常肌肉、皮下注射组分别免疫pCWIIP及对照质粒，在2、4、6、8 w眼后腔取血， 通过间接ELISA方法检测血清中抗preS的IgG抗体水平。结果：免疫组化 结果显示：基因枪肌肉注射组其IL-2-preS在肌肉中的表达明显高于正常肌肉组。间接ELI SA检测结果表明：抗preS的IgG抗体水平为基因枪＞正常肌肉组＞皮下注射组。 结论：在IL-2-preS融合蛋白表达质粒的基因免疫中，基因枪肌肉注射的方式优 于肌肉和皮下注射的方式，具有快速、经济和安全的特性，将为今后的临床广泛应用提供依 据。
中国图书分类号 R392
IL-2 and HBV preS fusion protein expression plasmid transfer into mouse muscle by jet-gun in vivo
SHEN Xiao-Fang MA Da-Long BAI Hui-Qing
（Depar tment of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083）
Abstract Objective：To observe the efficiency of DNA immu nization by jet-gun intramuscular injection of eukaryotic expression plasmid pC WIIP,which expresses the fusion protein,IL-2-preS,and to provide the basis for the study of hepatitis B gene immunization.Methods:Balb /c mice were divided into two groups:jet-gun and syringe.Each animal was immunize d with pCWIIP,pCIL-2 and pCI,respectively.Four days later,local muscles were ob tained,and IL-2-preS expression were detected immunohistochemically.In additio n,pCWIIP,pCIIL-2 and pCI were injected into Balb/c mice via jet-gun,syringe,an d epidermal.At interval of 0,2,4,6,8 w blood samples were harvested from eye s of the treated mice,and their serum anti-preS IgG were measured by indirect E LISA.Results:Immunohistochemistry showed that the use of t he jet-gun induced a significant higher expression in skeletal muscle cell than the use of syringe.Indirect ELISA showed that the levels of anti-preS IgG were in the following sequence from high to low:jet gun,intramuscular injection,and epidermal groups.Conclusion:For the immunization with pC WI IP plasmid,the jet-gun can offer better methods than those of syringe and epide rrmal methods,and would make immunization quicker and therefore less costly and more safety.It would provide the basis for the further clinical application.
Key words IL-2-preS Jet-gun DNA immunization Antibo dy
DNA免疫于1990年首次报道后，成为分子生物学和分子免疫学新的研究热点 。其免疫方法是将带有目的基因并能在真核细胞中表达的细菌质粒直接导入动物体内，通过 在体内表达目的蛋白从而引起机体对该蛋白的免疫应答。本室发现在小鼠体内接种IL-2 -preS融合 蛋白的真核表达质粒(pCWIIP)后能够诱导preS抗体的产生［1］，为进一步增强IL- 2-preS融合蛋白真核表达质粒的导入效率及诱发的免疫效果，我们用基因枪肌肉注射的方 法，对其在肌肉中的表达及诱导的免疫反应进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 小鼠 Balb/c小鼠，6～8周龄，雄性，购自北京医科大学动物部。
1.1.2 质粒 pCI质粒购于Promega公司，含有CMV立即早期启动子。pCWIIP 质粒是本室以pCI为基础构建的真核表达载体［1］，含IL-2 cDNA和HBVpreS融 合 蛋白序列。pCIIL-2由本室构建，含有IL-2基因及其信号肽序列，为真核表达载体。3 种质 粒均使用QIAGEN公司的DNA纯化试剂盒制备(QIAGEN，Hiden,Germany)。用前溶于0.9% 生理 盐水中，终浓度为1 μg/μl。
1.1.3 免疫组化染色SP试剂盒 购自北京中山生物技术有限公司。
1.1.4 抗体 抗preS2单抗由北京医科大学肝病研究所提供(效价 1∶200) ，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中山生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 基因枪 He Biolistic Particle Delivery System Model PDS-10 00由Bio-Rad公司生产，基因枪2.6 μm金颗粒购自Pharmacia,氦气压力1 100 psi(磅/英寸 2)。
1.2.2 基因枪免疫 基因枪金颗粒-质粒DNA复合体的制备及载药膜的预处 理参见试剂盒说明书。小鼠随机分3 组，每组为5 只。在免疫前行3% 戊巴比妥( 65 mg/kg)肌肉麻醉，将小鼠固定在板上，暴露胫前肌部位，基因枪注射pCWIIP 、pCIIL-2、pCI各10 μl/只(10 μg)。
1.2.3 直接肌肉注射 小鼠随机分3组，于胫前肌多点肌纤维走向注射pCWI IP、pCIIL-2、pCI各100 μl/只(100 μg)。
1.2.4 皮下注射 小鼠随机分3组，于背部皮下多点注射pCWIIP、pCIIL-2 、pCI各100 μl/只(100 μg)。
1.2.5 免疫组化检测局部肌肉组织表达preS情况 免疫后第4 天，取注射 部位的肌肉组织作冰冻切片，用免疫组化染色SP试剂盒检测肌肉组织中preS表达情况。
1.2.6 间接ELISA检测小鼠血清preS IgG水平 Balb/c小鼠随机分为9组， 每 组5只，分别用颗粒轰击法、正常肌肉注射、皮下注射的方法，胫前肌注射pCWIIP、pCIIL- 2、pCI质粒，在0、2、4、6、8 w眼后腔取血，用间接ELISA检测抗preS抗体。取P/N＞2.1 时的最高血清稀释度为终点滴度。
2 结果
2.1 免疫组化结果 小鼠正常肌肉注射(pCWIIP、pCIIL-2、pCI)后第 4天 ，经免疫组化SP法检测可见：
图1 基因枪注射pCWⅡP免疫组化(×40)
Fig.1 Immunohistochemical staining of pCWⅡP group by jet-gun(×40)[ ZK)
图2 质粒DNA免疫后诱发小鼠产生S抗体反应
Fig.2 The response of anti-preS IgG after immunization of pCWIIP plas mid
基因枪注射的肌肉组织细胞浆及胞膜上均有大量棕色颗粒,见 图1。
2.2 间接ELISA检测结果 在确认了上述表达质粒能够在肌细胞中表达相应 的融合蛋白后，取pCWIIP质粒DNA 10 μg基因枪注射，100 μg肌肉注射或100 μg皮下注射 后，用ELISA的方法检测各组混合血清中的抗体滴度。第4、6周抗体滴度达到最高峰，并且 抗体滴度一直保持在1∶1 280水平，见图2。
3 讨论
DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时 诱导体液免疫与细胞免疫。然而DNA疫苗的效率在某些方面并不如其他疫苗。由于DNA疫苗本 质是能在真核细胞中表达的细菌质粒，在真核细胞中无法复制，同时质粒并不是主动进入真 核细胞的，而是由组织细胞和其他炎症细胞、APC细胞被动摄取，其效率必然受到一定的影 响。
为了提高DNA疫苗的效率，人们尝试了许多方法。在DNA疫苗的构建上使用高效启动子如CMV 立即早期启动子及Intron序列，非甲基化CpG回文序列的导入等［2-6］。在免疫方 法 上也经过许多改进，其中电脉冲、基因枪的使用使质粒导入 效率大大提高［7-11］。肌肉注射方法上也尝试在质粒免疫前对局部进行预处理， 如预先注射布比卡 因、蛇毒素或者25% 蔗糖等，使局部受到一定免疫增强作用来提高DNA疫苗的效果，本室构 建的IL-2-preS融合蛋白的真核表达质粒用肌肉注射的方法已获得了初步的成功。
在此基础上我们进一步利用基因枪的方法和正常肌肉注射的方法进行比较，结果表明，免疫 第 4天可观察到preS抗原在肌肉中的高表达，在胞浆和胞膜上都有表达，且基因枪组明显高于 肌肉正常组，空载体对照组不表达，为基因枪的高表达提供了可靠和客观的依据。
我们又比较了基因枪、正常肌肉、皮下接种质粒诱导抗preS抗体产生的效果。对0、2、4、6 、8 w血清进行ELISA检测。结果表明，基因枪诱导的抗体水平明显高于正常肌肉组和皮下注 射组。因为基因枪的工作原理是将质粒以极高的速度进入细胞内并将质粒同时携入组织细胞 中，而皮内、肌肉注射则是将质粒液注入组织间隙，由细胞摄取质粒，因而效率不如基因枪 ，所以一般基因枪所需质粒仅为肌肉或皮内注射的1/1 000～1/100，本实验基因枪所用质粒 比肌肉、皮下注射少10倍，而产生抗体的最高抗体滴度之比却为10∶1∶1，这表明pCWIIP 可在体内分泌表达IL-2-preS，而基因枪方式可使体内基因转移效率明显提高，同时具有 迅速、安全等优点，可能为以后的基因治疗提供新的途径。
作者简介：沈肖方, 女, 30岁，免疫学专业硕士生；
马大龙 指导教师，男,47岁，教授,博士生导师，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
1，陈国章，马大龙，王 晶 et al.IL-2与HBV前S抗原融合蛋 白的真核细胞分泌表达.科学通报，1998；43(6)：781
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［收稿1999-06-29 修回1999-09-13］