肿瘤抗原冲击致敏的IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗肾癌的实验研究

肿瘤抗原冲击致敏的IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗肾癌的实验研究

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 肿瘤免疫学

作者：邱实　曹雪涛　弭静　袁正隆　雷虹　张明徽　朱学军　闵志廉

单位：邱实（第二军医大学长征医院泌尿外科，上海 200003）；曹雪涛（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）；弭静（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）；袁正隆（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）；雷虹（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）

关键词：肾细胞癌；巨噬细胞；白细胞介素2；基因治疗；免疫治疗

　　摘　要　目的：观察体外肿瘤抗原冲击致敏的白细胞介素2（IL-2）基因修饰的巨噬细胞对肾癌小鼠的治疗效果并探讨其相关的免疫机理。方法：通过重组腺病毒的介导，将IL-2基因转入新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞，经肿瘤抗原冲击致敏后回输治疗原位肾癌小鼠，采用4 h ⁵¹　Cr释放法检测脾脏NK和CTL活性。结果：IL-2基因修饰的巨噬细胞经肿瘤抗原冲击后体内回输可使肾癌小鼠肺转移结节明显减少，存活期明显延长，40%肾癌小鼠达到长期存活。治疗后荷瘤小鼠脾脏NK和CTL活性显著提高。结论：IL-2基因修饰的巨噬细胞经肿瘤抗原冲击后自体回输是治疗肾癌的有效方法。

　　中国图书分类号　R392.11　R737.11

Therapy of renal cancer with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages

QIU Shi， CAO Xue-Tao， MI Jing et al.

　　Department of Urology， Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003

　　Abstract　Objective: To investigate the treatment for renal cancer (Renca)-bearing mice with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages and their related immunological mechanism.Methods: Renca-bearing mice were infused with tumor antigen-pulsed， IL-2 gene-modified macrophages. The CTL and NK activities were detected by 4 h ⁵¹　Cr release assay. Results: Macrophages could be activated by auto-secreted IL-2 after IL-2 gene modification. If IL-2 gene-modified macrophages were pulsed with tumor antigen in vitro and then infused into Renca-bearing mice， pulmonary metastases of Renca-bearing mice were reduced，survival time prolonged apparently and 40% of mice were tumor free. After treatment， NK，CTL activities increased significantly.Conclusion: Infusion of IL-2 gene-modified、tumor antigen-pulsed macrophages might be an effective therapy for renal cancer.

　　Key words　 Renal cancer　Macrophage　Interleukin-2　Gene therapy　Immunotherapy

　　肾癌对放、化疗均不敏感，临床上对原发孤立性肾癌均采用根治性肾癌切除术，一旦肾癌淋巴结转移，即使行根治性淋巴结清扫术，患者生存期极少超过5年，如果出现肾癌肝、肺转移或邻近脏器浸润，则预后更差。巨噬细胞（Macrophage，MΦ）过继回输治疗肿瘤已应用于临床十余年，但疗效不理想，这是由于回输的巨噬细胞一旦失去外界的刺激，难以维持活化状态。作为一种新兴治疗方法，基因疗法为治疗肾癌提供了新的研究方向。我们将IL-2基因转入新鲜分离的巨噬细胞，初步证实IL-2基因修饰的巨噬细胞可持续稳定地分泌IL-2，增强了巨噬细胞杀伤活性和抗原提呈能力^［1，2］。在此基础上，我们用IL-2基因修饰的抗原冲击致敏的巨噬细胞过继回输治疗肾癌小鼠，并分析了相关的免疫机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　动物与细胞株　BALB/C小鼠，6～8周龄，雄性，由上海必凯实验动物有限公司提供；BALB/C小鼠肾细胞癌细胞（Renca）由美国国立癌症研究所Wiltroult博士馈赠；重组腺病毒包装细胞293细胞（人胚肾细胞）由德国MDC分子医学中心Blankenstein教授惠赠；Yac-1细胞由本室传代培养。

　　1.1.2　主要试剂　携带小鼠IL-2基因的重组腺病毒载体Adex1 CA mIL-2 (简称Ad-mIL-2)、携带LacZ对照基因的重组腺病毒载体Adex1 CA-RxZ(简称Ad-LacZ)由日本癌症研究会分子生物治疗研究部Hirofumi Hamada博士惠赠；放射线同位素Na₂⁵¹CrO₄购自Amersham公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　肿瘤抗原的制备　参见文献［3］。收集对数生长期的Renca细胞，用RPMI-1640配成1×10⁸ ml^-1，反复冻融4～5次，离心(5 000 r/min×30 min)收集上清，过滤除菌后用作肿瘤抗原(简称Ag)。大量制备同一批该肿瘤细胞冻融物，作为Ag供体内外实验使用，避免差异。

　　1.2.2　小鼠腹腔巨噬细胞的制备、IL-2基因修饰及抗原致敏　常规提取腹腔细胞，孵箱培养2 h后洗去悬浮细胞，可获得较纯的贴壁巨噬细胞。12mmol/L 利多卡因在37℃条件下消化巨噬细胞。按本室常规方法^［4］，将IL-2基因转染至新鲜分离的巨噬细胞，MOI值为50，同时设立LacZ基因病毒对照和未经基因修饰的细胞对照。IL-2基因修饰后24 h巨噬细胞悬液中再加入制备的肿瘤抗原（MΦ∶Ag为1∶5），作用4 h后，收集巨噬细胞，配成1×10⁷ ml^-1待用。

　　1.2.3　肾癌小鼠模型的建立和治疗　将对数生长期Renca细胞用RPMI-1640配成1×10⁶ ml^-1，取0.1 ml肾癌细胞于小鼠肾包膜下接种（1×10⁵/只），小鼠荷瘤3 d后随机分组并开始治疗。每只小鼠腹腔、尾静脉内各注射已配好的巨噬细胞悬液0.1 ml（2×10⁶ MΦ/只）。每3 d治疗1次，连续4次。观察小鼠存活期，每组10只；4 w后(包括4 w内死亡小鼠)计数肺表面转移结节数目，每组8只。

　　体内实验分组如下：A组：未治组；B组：RPMI-1640对照组(RPMI-1640)；C组：未处理的MΦ组(MΦ)；D组：未处理的MΦ+Ag组(MΦ+Ag)；E组：对照基因(LacZ)修饰的MΦ组(LacZ-MΦ)；F组：对照基因(LacZ)修饰的MΦ+Ag组(LacZ-MΦ+Ag)；G组：IL-2基因修饰的MΦ组(IL-2-MΦ)；H组：IL-2基因修饰的MΦ+Ag组(IL-2-MΦ+Ag)。

　　1.2.4　小鼠脾细胞CTL活性诱导　Renca细胞经30Gy ⁶⁰　Co照射灭活，用于体外CTL活性的诱导。无菌取小鼠脾脏，研磨过200目钢网制成单细胞悬液，用Tris-NH₄Cl溶破红细胞，洗3次，制成淋巴细胞悬液，直接进行NK活性测定，部分细胞用完全培养基调浓度为5×10⁶ ml^-1，将其与灭活的Renca细胞以20∶1的比例置于含IL-2 100 U/ml、10%FCS的RPMI-1640中培养，3 d后半量换液，7 d后检测CTL活性。

　　1.2.5　小鼠脾细胞NK活性及经诱导的CTL杀伤活性的检测　取第4次治疗后3 d荷瘤小鼠脾细胞检测NK及诱导的CTL活性，均采用4 h ⁵¹　Cr释放法。检测NK活性时选用YAC-1细胞为靶细胞；检测CTL活性时以Renca细胞作为靶细胞，以CT26小鼠结肠腺癌细胞作为对照靶细胞。效靶比为100∶1， 实验中自然释放率均低于15%。

　　1.2.6　统计学处理　采用未配对计量资料的t检验。

　　2　结果

　　2.1　治疗后荷瘤小鼠肺表面转移结节数　MΦ组和LacZ-MΦ组及相应的肿瘤抗原冲击组（MΦ+Ag组、LacZ-MΦ+Ag组）的荷瘤小鼠肺表面转移结节数与未治疗组、RPMI-1640组相比有明显下降（P＜0.05），而MΦ组、LacZ-MΦ组、MΦ+Ag组和LacZ-MΦ+Ag组之间无明显差异；单纯IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗组(IL-2-MΦ组)的小鼠肺转移结节数又比未治疗组、RPMI-1640组明显减少(P＜0.01)，如果该巨噬细胞体外再经肿瘤抗原冲击致敏后回输(IL-2-MΦ+Ag组)，则小鼠肺转移结节数进一步明显减少(P＜0.001，见图1)。

　　2.2　治疗后荷瘤小鼠存活期　IL-2-MΦ组的荷瘤小鼠存活期明显延长，10%小鼠达到长期存活（超过3个月）；如果再经体外抗原冲击后回输治疗，小鼠长期存活率达到40%。未治疗组、RPMI-1640组小鼠分别在30～32 d全部死亡； MΦ组、LacZ-MΦ组和MΦ+Ag组、LacZ-MΦ+Ag组仅能延长小鼠存活期，最长达52 d，无小鼠长期存活。肾癌小鼠死后解剖多见血性胸、腹水，肺部可见大小不等的结节性肿瘤转移灶，腹腔也可见种植性肿瘤结节(见图2)。

图1　IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗后肾癌小鼠肺转移结节数的变化

　　Fig.1　The number of pulmonary metastatic node in renal cancer-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages

　　Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：MΦ group；D：MΦ+Ag group；E：LacZ-MΦ group；F：LacZ-MΦ+Ag group；G：IL-2-MΦ group；H：IL-2-MΦ+Ag group 2.3　荷瘤小鼠NK活性的变化　未治疗组、RPMI-1640组、MΦ组和LacZ-MΦ组的小鼠NK活性较低，MΦ组和LacZ-MΦ组虽经肿瘤抗原冲击也不能引起NK活性显著增强；而IL-2-MΦ组NK活性显著增强（P＜0.05），IL-2-MΦ+Ag组的NK活性进一步增强（与IL-2-MΦ组比P＜0.05；与其他各组比P＜0.01），说明肿瘤抗原冲击致敏的IL-2基因修饰的MΦ可提高机体的非特异性免疫功能(见图3)。

　　2.4　荷瘤小鼠CTL杀伤活性的变化　MΦ+Ag组和LacZ-MΦ+Ag组的CTL活性比未经肿瘤抗原冲击的相应治疗组有所增强，但并不显著（P＞0.05）；而IL-2-MΦ+Ag组的CTL活性不仅比其他各组显著增强（P＜0.01），较IL-2-MΦ组也有明显增强（P＜0.05），说明肿瘤抗原冲击致敏的IL-2基因修饰的MΦ可提高机体的特异性免疫功能；各组CTL对CT26的杀伤活性均很低，且无明显差异，说明该CTL为Renca特异性。另外，与MΦ组比，LacZ-MΦ组的NK和CTL活性无明显变化，表明腺病毒的修饰对MΦ的功能无明显影响(见图4)。

图2　IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗后肾癌小鼠的存活期

　　Fig.2　Survival time of renal cancer-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages

图3　IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗后荷瘤小鼠脾脏NK活性

　　Fig.3　The NK activity of splenocytes from tumor-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages

　　Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：MΦ group；D：MΦ+Ag group；E：LacZ-MΦ group；F：LacZ-MΦ+Ag group；G：IL-2-MΦ group；H：IL-2-MΦ+Ag group

图4　IL-2基因修饰的巨噬细胞治疗后荷瘤小鼠脾脏CTL活性

　　Fig.4　The CTL activity of splenocytes from tumor-bearing mice after treatment with IL-2 gene-modified macrophages

　　Note:A:No treatment group；B：RPMI-1640 group；C：MΦ group；D：MΦ+Ag group；E：LacZ-MΦ group；F：LacZ-MΦ+Ag group；G：IL-2-MΦ group；H：IL-2-MΦ+Ag group

　　3　讨论

　　既往认为IL-2受体（IL-2R）仅存在于淋巴细胞表面，现研究发现它还存在于单核/巨噬细胞表面。未被激活的巨噬细胞并不合成IL-2R mRNA，而IL-2可促使巨噬细胞合成IL-2R mRNA，大量表达mIL-2R蛋白，同时IL-2诱导巨噬细胞分泌TNF、IL-1、NO，增强其细胞毒作用，因此IL-2对巨噬细胞的激活作用引起人们的关注^［5，6］。IL-2被美国食物和药品管理局唯一认可用于临床免疫治疗肾癌的细胞因子，能激活巨噬细胞，诱导T淋巴细胞增殖、分化，但因全身应用剂量大，副作用较多，体内半衰期短，临床上常选用IL-2活化的效应细胞过继免疫，如LAK/IL-2、TIL/IL-2。由于肿瘤细胞，特别是转移性肿瘤细胞异质性，使特异性杀伤细胞回输疗法不能有效地清除机体肿瘤，而巨噬细胞杀伤肿瘤作用不受肿瘤细胞异质性的限制。近年来，在体外活化的巨噬细胞过继回输治疗肿瘤，特别是转移性肿瘤方面，国外学者开展了大量的动物实验和临床研究，并取得了较为理想的抗肿瘤效果^［7，8］。过继免疫治疗实验研究多采用异位荷瘤（如皮下）或实验性肿瘤转移动物模型，实验结果与临床应用往往有很大差别；我们采用小鼠原位肾癌模型，其发病过程与肾细胞癌患者的临床过程相似，因此，动物实验结果能更好地指导临床治疗。

　　本研究结果表明，与未治疗组和RPMI-1640组相比，巨噬细胞或对照基因修饰的巨噬细胞经或未经肿瘤抗原冲击后回输治疗，肺转移结节明显减少，小鼠存活期延长，但无小鼠长期存活；单纯IL-2基因修饰的巨噬细胞回输治疗效果较明确（肺转移结节进一步明显减少，10％小鼠长期存活）；如果再行肿瘤抗原冲击致敏，则治疗效果又能进一步提高（肺转移结节又进一步明显减少，40％小鼠长期存活），治疗效果与NK和CTL活性正相关。同时，我们也发现，IL-2-MΦ+Ag组的CTL活性比IL-2-MΦ组明显提高，而MΦ+Ag组和LacZ-MΦ+Ag组的CTL活性较MΦ组和LacZ-MΦ组虽有所增强，但不明显，且治疗后小鼠存活期和肺转移结节数无明显差异。最近，有些实验显示巨噬细胞与肿瘤抗原接触后抗原提呈能力提高，杀瘤活性增强。体外吞噬凋亡小体的巨噬细胞表面分子MHC-I、MHC-II、B7-1、B7-2和ICAM-1表达增加，抗原提呈能力提高，如果再加入少量的IL-2，则抗原提呈能力显著提高^［8］；巨噬细胞经CTL MAGE-3.A2多肽体外冲击4 h后可引起CTL MAGE-3.A2细胞克隆活性显著增强，增强幅度与抗原冲击量呈正相关，但抗原冲击后巨噬细胞随着时间延长，对CTL活化功能迅速下降，每24 h下降70%～80%^［9］。我们认为，IL-2基因修饰的巨噬细胞能持续稳定地分泌IL-2，保持巨噬细胞的活化功能，协同并延长肿瘤抗原冲击对巨噬细胞抗原提呈能力的提高作用；巨噬细胞单纯行肿瘤抗原冲击，抗原提呈功能增强，甚至处于活化状态，但难以长时间维持，随着时间延长而迅速下降，诱导的CTL活性也迅速下降。所以，巨噬细胞是否处于和保持活化状态，对肿瘤抗原冲击致敏的巨噬细胞功能影响较大^［10］。IL-2基因修饰的巨噬细胞诱导机体非特异性杀伤功能增强，表现在NK活性提高，这与IL-2关系密切，已证实IL-2可直接诱导NK活性^［11］，而肿瘤抗原冲击可增强IL-2的作用。NK在抗肿瘤过程中也发挥着积极的作用，anti-CD122单抗去除NK细胞，可明显降低IL-2基因修饰的神经母细胞瘤的抗肿瘤作用^［12］。

　　总之，肿瘤抗原冲击致敏的IL-2基因修饰的巨噬细胞回输疗法是治疗肾癌的一种有效方法，回输体内的巨噬细胞不仅可以直接发挥其非特异性肿瘤杀伤功能，而且可通过抗原提呈作用，激活机体特异性免疫力，进一步增强抗肿瘤作用。该方法以小鼠原位肾癌为模型进行治疗，取得了良好的疗效，为临床治疗肾癌提供了新的思路。

　　本课题受上海市优秀学科带头人计划资助(97XD1406)

　　作者简介：邱　实，男，33岁，博士，主要从事肿瘤免疫的研究；

　　闵志廉，男，58岁，博士生导师，主要从事普通泌尿和移植免疫的研究

　　张明徽（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）

　　朱学军（第二军医大学免疫学教研室，上海200433）

　　闵志廉（第二军医大学长征医院泌尿外科，上海 200003）

　　4　参考文献

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［收稿1999-11-01　修回2000-02-28］