生物技术在中药材品质改良、保护和鉴定等方面的应用

    生物技术是一门建立在现代生命科学理论基础上的技术，随着生命科学领域研究的突飞猛进，生物技术变得更加强有力，已渗透到工、农、医、林等各个领域并发挥着日益重要的作用。生物技术在中药领域的应用是中药现代化的一个重要组成部分，它在中药材品质改良、资源保护和鉴定等方面有着广阔的应用前景。现就生物技术在中药领域的主要应用作一些介绍。
1多倍体育种技术
从20世纪40年代起，国外已经开始将多倍体技术用于植物的品种改良，我国于20世纪70年代开始亦已将这一技术用于药用植物的品种改良，并取得可喜的成果。
1．1多倍体药用植物的优点
抗性增强：由于多倍体植株一般较矮，茎杆粗壮，故能较好的抗倒伏。有的还具有抗旱、抗涝、抗病和抗寒等抗性。例如菘蓝Isatis irMigotica的同源四倍体植株具较好的抗涝和抗旱特性。由家薄荷Mentha aruensis var．piperascens和库页薄荷M．gachalinensis诱导生成的异源四倍体具抗粉霉菌、抗寒等优点。在高原地带的植物常有多倍体变种，这也从一个侧面说明了多倍体植物对寒冷等气候条件有着较强的适应性。这些优点对扩大种植区域，提高产量及野生品种变栽培品种极为有利。
1．2成分的变化
    多倍体植株通常具有较高的活性成分的含量。在实践中发现，大多数多倍体中次生代谢产物的含量都有所增加，例如蔓陀罗同源四倍体中生物碱含量大约是原植物的2倍，怀牛膝同源四倍体中蜕皮激素较原植物高出达10倍之多_，丹参同源四倍体中隐丹参酮，丹参酮IA，丹参酮ⅡA分别较原植物高203．26％，70．48％，53．16％。染色体倍性的增加与化学成分含量的变化并不呈正比关系，例如毛蔓陀罗的三倍体生物碱含量较二倍体、四倍体均高。
多倍体与原植物比较，并不只限于原有性状的加强和提高，有的可能会产生新的性状和新的化学成分，例如福禄考 Phlox drummondii的同源四倍体中能够产生亲本所不含有的黄酮类成分，菘蓝同源四倍体中游离氨基酸成分组成与二倍体亲本相比也不尽一致，从中可能筛选到具有药理活性的前导化合物。
1．3体积的变化
多倍体植株的农艺性状通常有明显变化，突出表现在根、茎、叶等器官上具有巨型性，这能大幅度提高以相应部位人药的药材的产量，例如丹参同源四倍体普遍比原植物生长势旺而浓绿，茎杆粗壮，植株高，根部药材比原植物粗大；菘蓝同源四倍体较原植物叶子宽大而厚实，茎杆粗壮，花、果实也显著增大；怀牛膝同源四倍体根的干重较二倍体有显著提高，但其木质化程度却比二倍体低，说明质量也有所提高。
1．4多倍体植物的产生
    自然界产生多倍体的过程相当漫长，因此经常需要通过人工诱导的方法获得多倍体植株。人工诱导通常有以下几种方法：①物理诱导：通过打顶，或高温、低温处理授粉后的幼胚，以及采用射线、中子、激光等辐照来获得多倍体。这些方法效率低且不稳定。②化学诱导：用秋水仙素处理植物的生长点，秋水仙素所用浓度一般为0．01％～1．0％，视植物种类不同而不同。秋水仙素不影响染色体的复制和分裂，它的作用是防止纺锤体的形成，使细胞不分裂。例如乔传卓等用0．05％-0．5％的秋水仙素处理菘蓝(2n=14)种子和茎顶生长点6～12h，均获得四倍体植株(2n=28)。也有用富民农(甲苯磺硫胺基苯汞)作诱变剂的，例如远泓等用0．0l％富民农处理当归(2n=22)幼苗生长点48～72h获得当归同源四倍体植株(2n=44)。
    利用组织培养技术诱导多倍体是近几年发展起来的一种新的诱导多倍体的方法。例如陈素萍等在诱导党参多倍体时将一定浓度的秋水仙碱加入培养基中，使种子在发芽中逐渐被诱变加倍，然后通过组织培养的方法获得大批量的再生植株。陈柏君等诱导黄芩同源四倍体时采用组织培养的方法先获得愈伤组织，然后转移到分化培养基上诱导生芽，当培养基上长出绿色芽点时，将带芽点的愈伤组织置于含有秋水仙素的培养基上培养，或放入秋水仙碱水溶液中浸泡，最后依次经分化及生根培养基培养获得再生植株。
    利用组织培养技术诱导多倍体操作简便，实验条件容易控制，重复性好，诱导效率高，嵌合体少，易于大批量处理和筛选，筛选出的优质株系可以应用组织培养技术在短期内大量繁殖，大大地缩短了育种周期。
通过花药／小孢子离体培养，诱导形成单倍体，经自然或人工染色体加倍形成完全同质的加倍单倍体植株。借助加倍单倍体植株，可以快速组合多种有益性状于一体，加速回交、回交后代的纯合，缩短育种年限，还可以提高选择效率，简化育种程序。
2药用植物及其活性成分的工业化生产
植物中含有很多药用活性成分，从植物中提取的活性成分在疾病的防治方面起到了相当重要的作用，但有些药用植物由于过度采挖，已出现了资源枯竭现象，因此通过工业化手段来生产某些重要的药用植物及其活性成分受到了重视。
2．1试管苗快速繁殖技术
试管苗快速繁殖技术是目前很成熟的一项技术。它利用植物细胞的全能性，诱导器官分化，繁殖大量无性系试管苗，使植物种苗实现工业化生产，可广泛用于药用植物栽培、育种、良种繁育等领域，具有繁殖量大、速度快和减少病毒的优点，对药材质量和产量都非常有益。到目前为止已有100多种药用植物经过离体培养获得试管植株。
2．2组织培养、细胞培养生产药用活性成分
    由于药用植物愈伤组织培养物中也含有药用活性成分，所以最初人们利用植物愈伤组织培养米提取活性物质，但由于愈伤组织培养物生长缓慢，合成次生代谢物质的能力低且不稳定，真正进入工业化生产成功的例子还很少。
细胞培养是广义组织培养的一种，是将游离的细胞悬浮在液体培养基中进行培养的一种方法。悬浮细胞培养时细胞增殖速度比愈伤组织快得多，并且适合于大规模培养。我国科学工作者已经建立了三七、人参、三尖杉、长春花、丹参等十几种药用植物的液体培养系统。中国药科大学进行了人参的10L体积的大规模培养并对其培养细胞进行化学成分和药理活性比较分析，结果与种植人参无明显差异，目前已作为美容保健品投放市场，这是我国中药生物技术产品第一个商品化的例子。
2．3毛状根培养
    许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长出大量的不定根，称为毛状根。毛状根是农杆菌中Ri质粒的一段 DNA嵌入植物基因组中并表达的结果，因此毛状根培养又被称为转基因器官培养。科学家们认为亲本植物能够合成的次生代谢产物都可用毛状根培养来生产，因而这是一条利用生物技术生产次生代谢产物的新的有效途径。应用毛状根培养生产的次生代谢产物有生物碱类(如吲哚类生物碱、喹啉生物碱、莨菪烷生物碱、喹嗪烷生物碱)、苷类(如人参皂苷、甜菜苷等)、黄酮类、醌类(如紫草宁等)以及蛋白质(如天花粉蛋白)等。利用毛状根培养生产次生代谢物具有以下优点：①生长迅速：毛状根具有大量的分枝和根毛，生长快速，具有激素自养性，可用于大量培养。例如金养麦(Fagopyrum)的毛状根液体培养25d可增殖1861倍而其细胞培养物只增值26．7倍。②合成能力强且稳定：因为外源生长激素能够抑制次生代谢产物的产生，而毛状根中含有的T-DNA片段上有生长素合成酶基因，所以毛状根表现为激素自养性，有利于产生次生代谢产物。毛状根的次生代谢物的含量一般比愈伤组织和悬浮培养的细胞高，并且能够合成某些愈伤组织和悬浮培养细胞不能合成的次生代谢物，例如长春碱和长春新碱是存在于长春花(Catharanthus Foseus)中的具有抗癌作用的吲哚类生物碱，通过长春花细胞培养一直未能获得这两种生物碱，但在长春花的毛状根中检测到了这两种生物碱；短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的毛状根中紫杉醇的含量是其愈伤组织中的近8倍。毛状根中某些次生代谢物的含量甚至可能比原植物还高，例如Shimo— mura等诱导获得的人参毛状根在无外源激素的条件下，人参皂苷(Rb和Rg)的含量可达干重的0．95％，比当地栽培的人参根中相应皂苷的含量(0．4％)高出一倍多。由于毛状根是细胞分化而来的根组织，属于单克隆体，具有遗传稳定性，它不仅染色体数目与亲本保持一致，而且合成能力、合成模型及生长速度也很稳定，这对工业化生产十分重要。例如无刺曼陀罗(Datura Stramoniium)毛状根继代培养5年以上仍保持合成托品烷生物碱的稳定性。③向培养液释放代谢产物：毛状根可将部分次生代谢产物分泌释放到培养液中，有利于次生代谢产物的回收提取和工业化生产，例如 Shimomura等诱导紫草(Lithospermum ervthrohizon)产生的毛状根在2L气升式反应器中生长迅速，通过与反应器连接的Amberlite XAD-2大孔树脂将分泌到培养液中的紫草色素回收，每天可吸附5mg紫草色素，且可连续生产220d。短叶红豆杉毛状根也能向培养液中分泌0．01～0．03 mg· L-1的紫杉醇。
另外，毛状根还具有高度的繁殖潜能，可以制成人工种子(artificial seed)长期保存，例如Uozumi等将带有顶端分生组织或分枝的辣根(Armoracia rustzcana)毛状根切段用海藻酸钠凝胶包裹制成的人工种子，能再生成整个植株。
3转基因药材
    目前转基因的方法主要有3种：农杆菌(Ri质粒或Ti质粒)介导的基因转移；种质系统的基因转移(如子房注射、种胚及花粉等途径导人外源基因)；外源基因直接导入法。
构建转基因植物主要有以下几个目的：①改进植物品质及适应性：一种是植物质量上的改变，如作物蛋白质的改变；另一种是植物抗性的改变，包括抗旱、抗盐、抗热等。②抗虫：虫害是农业和中药材生产一大害，化学药剂杀虫不仅成本高，而且严重污染环境。人们发现苏云金杆菌(Bacillus thuringievtsis)体内存在一种能杀死一部分昆虫的结晶的蛋白毒素一δ内毒素，1987年科学家们成功地从苏云金杆菌中分离出了这种毒素的基因，并把它们转入了烟草、番茄和马铃薯中，结果这些转基因植物杀虫效果良好，毒素基因能够稳定遗传，而且毒素对人、畜无害。③抗除草剂：一种方法是把除草剂作用的酶或蛋白质的基因转入植物，使其拷贝数增加，从而使转基因植物中这种酶或蛋白质的浓度大大增加，使除草剂的浓度不足以全部破坏植物体内的这种酶或蛋白，这样植物就不会被杀死；另一种方法是转移一种能以除草剂为底物的酶的基因到植物中去，该基因编码的酶在转基因植物中将除草剂催化掉，从而保护植物不被杀死；还有一种方法，针对除草剂能识别其作用的酶上的相应位点这一特点，用基因突变的方法使该位点七的相应氨基酸发生突变，使除草剂不能识别它，但这个酶的二级结构和酶促功能并不受影响，植物仍可正常生长。目前应用最广的抗除草剂基因一一 bar基因作用机制就属于后一种。④抗病毒：应用最广的是向植物中转入病毒的外壳蛋白基因，例如1986年美国科学家Beachy将烟草花叶病毒(TMV)U1株的外壳蛋白的cDNA转入烟草细胞，结果转基因植物及其后代都高水平地表达了外壳蛋白，并具有明显的抗病毒特性。另外还可以向植物中转入病毒的RNA基因、病毒的反义RNA基因、植物自己编码的抗病毒基因等，获得的转基因植物都具有抗病毒活性。⑤用于医药生产：目前国际上植物基因工程的一个热点就是利用转基因植物生产药物。1988年比利时科学家将一个神经肽(enkephelin)的编码基因转入烟草中，得到的转基因烟草表达出高产量的神经肽；1989年美国科学家将抗体的重链基因和轻链基因分别克隆，并分别转入烟草中，然后让这两种烟草杂交，结果在子代的烟草叶片中产生了大量的单克隆抗体，其表达水平达到叶子总重量的1，3％。迄今为止，国外已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功表达，其中包括了人的细胞因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等。相信不久的将来，会有越来越多的用植物基因工程生产的药物问世。
4在中药鉴定方面的应用
    解决中药材真伪优劣问题仍然是实现中药现代化中的一项极为重要的任务。在中医药长期的实践中已经形成了四大鉴别方法(来源、性状、显微、及理化鉴别)，其中理化鉴别在几十年中发展特别快，然而现有的方法尚无法完全解决中药鉴别中存在的问题。
  生物的性状是依靠DNA遗传给后代的，不同种的生物，甚至同种不同居群的生物，其DNA序列均小相同，这为用 DNA分析技术鉴定中药提供了可能。目前应用在中药鉴别上的生物技术有3种。
4．1 DNA指纹图谱技术(DNA Fingerprining)
    DNA指纹图谱技术是近年来发展起来的一组可以检测出大量DNA位点差异性的分子生物学新技术，因它的电泳谱带千变万化，如同人的指纹一样富于鉴别性而得名。这一技术自1985年由Jeffrency命名以来，现已发展成包括RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)、PCR(聚合酶链式反应)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)和 RAPD(random amplified polymorphic DNA)等在内的一组技术。
    限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)：如果两种植物不同，其DNA分子也一定会有差别，即使是很小的差别，经限制性内切酶消化后所得的限制性酶谱的条带方式将出现不同，即产生多态性。对这些条带进行分析可从中获得两种DNA分子结构差异的信息。但由于高等植物的染色体太大、太复杂，用限制性内切酶降解后很难在琼脂糖凝胶上看到DNA片段的多态性，通常我们看到的是弥散状的DNA(因为条带太多太密集了)。通常人门采用Sourthem杂交来解决，即将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜上，然后用标记的探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。该方法可以有效地研究种问、属间的 DNA的变异情况，从而揭示小同种间的亲缘关系，也为鉴别药材品种提供依据。
  聚合酶链式反应(PCR)：是1985年发明的一种模拟自然DNA复制过程的快速体外DNA片段扩增技术，又称无细胞分子克隆技术。该技术的问世，为中药鉴别提供了一条新途径。虽然药材(不含矿物药)多不是新鲜的，DNA会有很大的降解，但PCR能将原来痕量的DNA扩增到足以供检测和分析的数量，而且产物专一性强，不需进行特殊纯化，具有高效、高速、优质和全部自动化的优点。
  PCR技术的诞生使口的基冈极易获得，再做RFLP分析，由此产生一个新的AFLP(anplified fragment length poly— morphism)方法，如IK2R-RFLP，RAPD-RFLP技术。AFLP技术有以下优点：不需使用同位素，减少实验室污染；不需提纯 DNA；不需经过测序。例如Fushimi等采用PCR-RFLP方法对人参属3种植物人参(Panaax  ginseng)、西洋参(P．quin— quefolius)和竹节参(P．japonicrs)进行了核基因组18S-rRNA片段(1．8kb)分析，结果发现BanⅡ和DdeI酶解的指纹图谱较易将其区别开来。
随机扩增多态DNA法(random amplified polymorphic DNA，RAPD)：是在PCR基础上发展起来的，它采用9～10个寡核苷酸的随机引物进行扩增，小需预知被研究的植物基因组核苷酸顺序。该方法通用性很强，尤其在目前绝大多数动植物中药没有基因组DNA资料的情况下，RAPD技术较 RFLP等其它分子生物学技术具有更广阔的应用范围和前景。如张荣用RAPD技术成功鉴定了木蓝属8种中药。
4．2 DNA测序法
基于PCR的DNA直接测序技术是以PCR扩增产物作为测序引物，极大地提高了DNA序列分析的效率。目前用于DNA测序的基因，主要有叶绿体基因组的rbcL，matK与核基凶组的rRNA，ITS等(植物类)，线粒体基因组的cyt-b(动物类)。RbcL一般用于科级以卜分类群研究。MarK位于trnK基因的内含子中，长约1500碱基，编码成熟酶并参与RNA转录体中Ⅱ型内含子的剪切，一般用于种一级分类群亲缘关系研究。rRNA是编码核糖体DNA的基因，在动植物中以重复连续排列方式存在，可选择较保守的片段如18S，12S，5s的rRNA进行各种亲缘关系研究。ITS(内转录间隔区)在核糖体DNA中位于18S和26S之间，由5．8S基因分为ITSl和ITS2，在被子植物中ITS存在下高重复的核糖体 DNA中，片段长度仅为700bp(ITSl和ITS2各为350bp)，一般用于种下一级分类群亲缘关系研究，同时核基因是双亲遗传，不同于叶绿体的单亲遗传，能反映真正的进化历程，使得核基凶在中药品质研究中具有重要意义。
4．3生物芯片(biological chip)
生物芯片是20世纪80年代末发展起来的一种尖端技术，是分子生物学和电子学融汇的产物。牛物芯片主要包括基因芯片(gene chip)和肽芯片(peptide chip)，是指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子(DNA，RNA，多肽等)固定于支持物(膜、玻璃片、硅片等)上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，从而对样品分子进行定性、定量和结构分析。其原理是利用生物大分子问具有特异相互识别的能力，如核酸间的碱基互补配对，抗原与抗体的特异结合等。生物芯片鉴别中药具有快速、准确和自动化的优点。例如李绍平等对川贝母、浙贝母、皖贝母和湖北贝母等四种主要贝母品种5S rRNA的序列分析时发现，川贝母有一特异性的碱基序列CTTTTGTCG— CATCA，以此序列为探针制成芯片，将待检测样品提取DNA并经扩增和荧光标记后与芯片上探针进行杂交，然后通过荧光检测即叮准确鉴定出川贝母。要实现基因芯片技术鉴定中药，必须全面研究中药的基因组特征，目前对中药的特征DNA序列知之甚少，远不能满足基因芯片鉴定中药的要求。
5保存药用动植物种质资源
    目前世界种质资源日益枯竭，大量有用基因损失，特别是那些不产籽植物或种子寿命短的植物更为严重，因此寻找合适的方法保存种质资源显得非常重要。过去用定期继代培养的方法来保存，但继代培养工作量大，培养的时期过长可能会发生突变和丧失再生能力。近年来运用超低温保存技术已日益成为一种较为理想的保存种质资源的新方法。
将要保存的材料置于适宜的低温条件下进行一定时间的预处理以提高抗冻能力，放人冰冻保护剂(如二甲亚砜、丙三醇、聚乙二醇等)中，置于液氮中(一196℃)保存。被保存的材料既不会发生遗传上的变异，也不会丧失形态发生的潜能。
6小结
    纵观近几十年中药事业的发展，是在吸收了各个学科的先进理论和技术的基础上才得以迅速发展的，为此，我们要实现中药现代化，除需中药工作者坚持不懈的努力外，还需特别注意吸收和利用当前各学科出现的先进技术和方法，其中尤其是迅速发展的分子生物学和生物技术。我们相信，随着这一学科和技术在中药研究与开发应用中的不断深入，中药的发展将会产生革命性的变化。
                            摘自《中国药学杂志》文/许铁峰，张汉明，张磊，郭美丽，唐克轩