灯盏细辛注射液对大鼠青光眼模型的保护作用

【摘要】  　　目的 观察灯盏细辛对视网膜的保护作用。方法 采用前房灌注生理盐水法形成150 cm H2O（14.63 kPa）高眼压，诱导大鼠视网膜缺血60 min，建立急性青光眼模型。模型加药组：在青光眼模型的基础上腹腔注射6％灯盏细辛液1次，剂量150 mg/kg；加药对照组：给予腹腔注射0.5 ml生理盐水。急性高眼压60 min，分别在3、5、7 d观察视网膜节细胞数及视网膜各层厚度。结果 模型加药组节细胞数及IPL、INL厚度与实验对照组比较均有显著增多或增厚。结论 灯盏细辛对实验性青光眼具有保护作用。

【关键词】  灯盏细辛　青光眼　缺血再灌注　视网膜神经节细胞

　　The protective effect of  Herba Erigeromtis against glaucoma of SD rats

　　SUN Hui  LI Qingchun  LI Youjie  et al

　　Department of Physiology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603

　　【Abstract】  Objective  To observe the effects of Herba Erigeromtis against ischemia reperfusion injury in the rat retina．Methods  Retinal ischemia was induced in SD rats by raising the intraocular pressure to 150 cm H2O（14.63 kPa）for 60 min．The rats in treatment group were agiven an intraperitoneal injection of Herba Erigeromtis at a dose of 150 mg／kg，and the rats in control group an intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride at a dose of 0.5 ml.The density of cells in the retinal ganglion cell layer and the thickness of every layer in retinal which were in the treatment group and the control group were observed at 3 d,5 d and 7d after retinal ischemia.Results  The data which was the density in RGCs and the thickness of layers in retinal of the treatment group was larger than that of the control group.Conclusion  It suggests that Herba Erigeromtis may provide protection against retinal ischemia reperfusion injury．

　　【Key words】  Herba Erigeromtis，glaucoma，ischemia  reperfusion，retina

　　灯盏细辛（Herba Erigeromtis,Her）,性味甘温，具有散寒解表、活血化淤、止痛消积、祛风除湿等功能［1］。青光眼为临床常见眼病，主要表现为原发或继发眼压升高，进而损伤视网膜，影响患者视野，甚至致盲。临床研究显示灯盏细辛对原发性青光眼患者的视野有一定保护作用［2］，我们对灯盏细辛治疗青光眼的机制进行了初步研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂及仪器

　　1.1.1  试剂：4％水合氯醛、4％中型甲醛、1%氯霉素眼药水、1％利多卡因（滨州医学院附属医院制剂室）、6％灯盏细辛注射液（云南生物谷灯盏花药业有限公司,批号：20061103）。

　　1.1.2  仪器：光学显微镜（NIKON公司）、石蜡切片机（德国Nussloch）。

　　1.2  实验动物  健康、成年雄性SD大鼠（山东大学实验动物中心提供），60 只，体重200～300 g。将大鼠随机分为四组：正常对照组15只，模型组15只，模型加药组15只，加药对照组15只。

　　1.3  高眼压模型建立及加药  大鼠4％水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，1％利多卡因滴眼，将连接生理盐水瓶输液管的5号头皮针刺入前房，保持输液瓶与大鼠垂直高度150 cm，此时眼内压为14.63 kPa。眼底镜观察可见视网膜缺血苍白、水肿，眼头皮针底血流阻断，15～30 min后球结膜水肿苍白，眼球变得不透明［3，4］。实验过程中，动物体温保持在36～37℃，随时滴加生理盐水保持角膜湿润。模型建立完成拔掉头皮针，滴加1％氯霉素防止感染。各组处理见表1。

　　表1  实验分组及各组处理过程（略）

　　1.4  标本采集  按预先分组在第3、5、7天断头处死大鼠，迅速摘除眼球，亚甲兰标记角膜上极及视神经短端。角膜上扎一小孔，浸润于4％中型甲醛中固定24 h，将固定好的眼球通过角膜上极和视神经断端对称剖开眼球，梯度酒精脱水，浸蜡。常规石蜡包埋，连续4 μm切片，常规苏木精伊红染色。

　　1.5  显微镜观察  采用摄像显微镜观察并照相，计数高倍视野内视网膜节细胞数目并测量视乳头周围1 mm处视网膜各层厚度。

　　1.6  统计学分析  实验数据以x±s表示，采用t检验分析结果，P<0.05有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  视网膜神经节细胞的观察  正常对照组大鼠视网膜节细胞排列紧密整齐，细胞核均匀深染，胞核大小一致（图1），单位视野内节细胞数见表2。模型组大鼠视网膜节细胞排列稀疏且不规则，细胞核固缩，有些出现空泡、碎裂，部分细胞核溶解，细胞核大小不一（图2）,单位视野内节细胞数见表2，与正常对照组比较显著减少（P<0.05）。
   
　　模型加药组大鼠视网膜节细胞排列较整齐，有些细胞核出现固缩、碎裂，但大部分细胞核完好，细胞核大小也较一致（图3），单位视野内节细胞数见表2。加药对照组大鼠视网膜节细胞节细胞改变类似模型组，节细胞排列散乱、稀疏，胞核固缩、溶解，细胞核大小不一（图4），单位视野内节细胞数见表2，与模型加药组节细胞数比较具有显著性差异（P<0.05）。

　　表2  视网膜节细胞数目比较（略）

　　注：*表示与正常对照组比较，P<0.05；＃表示与加药对照模型组比较，P<0.05

　　2.2  视网膜各层厚度及形态的观察  正常对照组大鼠视网膜各层结构完整，排列整齐；各层厚度见表3、4、5；模型组大鼠视网膜节细胞层（GCL）水肿结构松散，内丛状层（IPL）厚度变薄且出现空泡水肿，内核层（INL）厚度变化不大，但个别细胞核固缩，外丛状层（OPL）厚度无明显变化，无水肿出现，外核层（ONL）厚度无变化，细胞核无固缩，排列整齐，各层厚度见表3、4、5。其中，IPL和INL厚度与正常对照组比较具有显著性差异（P<0.05）。
   
　　加药对照组大鼠视网膜形态及厚度变化与模型组类似，GCL水肿松散，IPL变薄且出现水肿，INL厚度变化不大，个别细胞核固缩，OPL厚度无变化；ONL厚度正常，细胞核排列整齐，各层厚度见表3、4、5；模型加药组大鼠视网膜GCL水肿不明显，细胞核排列较整齐，IPL厚度变化不明显个别位置空泡水肿，INL、OPL、ONL厚度无变化，细胞核无固缩，排列整齐，各层厚度见表3、4、5。其中，IPL和INL厚度与加药对照组比较具有显著性差异（P<0.05）。

　　表3  IPL厚度比较（略）

　　注：*与正常对照组比较，P<0.05；＃与加药对照模型组比较，P<0.05

　　表4  INL厚度比较（略）

　　注：*与正常对照组比较，P<0.05；＃与加药对照模型组比较，P<0.05

　　表5  ONL厚度比较（略）

　　注：*与正常对照组比较，P<0.05；＃与加药对照模型组比较，P<0.05

　　3  讨论
   
　　本实验通过建立大鼠的青光眼模型，研究了灯盏细辛对青光眼导致的视网膜损伤起怎样的保护作用。青光眼是一种临床常见的疾病，也是一种重要的致盲眼病。临床及基础研究证明青光眼是由于各种原因导致的眼内压升高导致视网膜中央动脉缺血，引起中央动脉供血的视网膜INL、GCL、IPL等处损伤，尤其是GCL由于缺血导致的细胞凋亡，这也是青光眼致盲的主要原因。灯盏细辛在临床广泛用于治疗青光眼，能对患者的视野起到一定的保护作用。我们的研究表明灯盏细辛可以减轻大鼠高压眼对视网膜，特别是视网膜神经节细胞的损伤，从而对大鼠实验性青光眼有一定的保护作用。
   
　　我们认为这与灯盏细辛对细胞凋亡有一定的抑制作用有关。很多研究都证明灯盏细辛可以抑制细胞凋亡的发生。灯盏花注射液的有效成分是灯盏花素，徐光等［5］的研究表明，灯盏花素是在黄芩素的4位接上一个羟基，其对蛋白激酶C（PKC）有很强的抑制作用，灯盏花可防止缺血诱导的PKC的移位激活。而PKC的激活参与了缺血诱导神经元凋亡，其具体机制如下：①PKC激活促进了缺血条件下神经元的钙超载［6，7］；②PKC可以激活PLA2和PLD，使自由基生成增加，促进了神经元的凋亡；③PKC激活cfos表达参与了神经元的凋亡；④PKC激活通过血管机制，加重缺血缺氧促进了神经元的凋亡。灯盏花可以防止缺血诱导的PKC激活，从而起到防止缺血诱导神经元凋亡的作用。此外，还有研究证明灯盏细辛可以降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性表达的细胞数量［8，9］，起到防止缺血诱导的细胞凋亡。
   
　　由此可见，灯盏细辛对于缺血诱导的细胞凋亡的抑制作用是多途径的，它可能是一种有效的治疗保护青光眼视网膜节细胞的药物。

【参考文献】
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作者单位：滨州医学院生理学教研室 滨州市 256603；滨州医学院生物化学教研室；烟台市血液中心