胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响

【摘要】  　　目的 研究胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响。方法 胃肠平滑肌细胞离体培养，分为5组：空白对照组、西沙必利组（0.51 mg/ml）、胃肠舒Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒Ⅲ组（75 mg/ml），采用CelltiterGloTM法和若丹明荧光法分别检测了胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞ATP和线粒体跨膜电位的的影响。结果 胃肠舒片作用24 h后与对照组和西沙必利组相比能显著增高平滑肌细胞ATP的含量（P<0.05），随着胃肠舒用药浓度的增高ATP的含量也增高；流式细胞仪结果表明胃肠舒明显加大了胃肠平滑肌细胞的线粒体跨膜电位，并且随着胃肠舒用药浓度的增高，跨膜电位也增高。结论 胃肠舒可能通过改变胃肠平滑肌细胞线粒体的跨膜电位促进了胃肠运动。

【关键词】  中药胃肠舒片　ATP　线粒体跨膜电位

　　Effect of traditional Chinese medicine Weichangshu on mitochondrial potential of gastrointestinal smooth muscle cells in rats

　　SONG Xiaodong  LIU Meng＇an  SUN Fengrun  et al

　　Basic College of Binzhou Medical University,Binzhou 256603; Clinical College of Binzhou Medical University, Binzhou 256603

　　【Abstract】  Objective  To study the effect of Weichangshu on the mitochondrial potential of gastrointestinal smooth muscle cells.Methods  Gastrointestinal smooth muscle cells were divided into 5 groups, as following.①Control group: cultured in normal medium.②Cisapride group: cultured in normal medium with 0.51 mg/ml Cisapride.③Weichangshu Ⅰ group: cultured in normal medium with 25 mg/ml Weichangshu.④Weichangshu Ⅱ group: cultured in normal medium with 50 mg/ml Weichangshu.⑤Weichangshu Ⅲ group: cultured in normal medium with 75 mg/ml Weichangshu. CelltiterGloTM was used to detect ATP. The relative changes in mitochondrial potential were tested with rhodamine fluorescence (R123) technique. Results  After exposure to Weichangshu for 24 h, the change of ATP content was more significant (P<0.05) and the intensity of R123 fluorescence in gastrointestinal smooth muscle cells was significantly increased compared with those in the control group and cisapride group. With the concentration of  Weichangshu increasing, the content of ATP and mitochondrial potential increased too.Conclusion  Weichangshu might change the mitochondrial potential of gastrointestinal smooth muscle cells to  improve gastrointestinal motility.

　　【Key words】  traditional Chinese medicine Weichangshu tablet, ATP, mitochondrial potential    

　　胃肠运动障碍型疾病，是临床常见病，据国内统计约占胃肠专科门诊患者1/3以上，西方国家患病率高达20%～40%。现临床最常用的促胃肠动力药有胃复安、吗丁啉、西沙必利等化学药，化学药促进胃肠蠕动虽然有较好疗效，但其副作用如药理作用受限、催乳素增加、焦虑、激动、运动性不安、共济失调、腹泻、腹痛等不可忽视，且易于复发。而取之于天然的中药制剂由于具有治疗与调理双层作用，避免了化学药的毒副作用，人体不会对中药产生依耐性，服用安全等优势，受到越来越广大胃病患者的欢迎。但目前国内外有关中药胃肠动力药的研究少见报道，因此研究胃肠运动障碍型疾病的发病机制，开发中药治疗该类疾病具有重要意义。
   
　　纯中药制剂胃肠舒片是本项目组人员根据《伤寒论》大承气汤、小承气汤、调胃承气汤三方化裁，取大黄、枳壳、甘草组方，经临床反复药物筛选研制而成的纯中药制剂，具有完全知识产权。前期预实验显示胃肠舒对胃轻瘫综合征的疗效优于吗丁啉，对小鼠子宫切除术后肠道推进作用优于西沙必利，能显著加快小鼠胃肠推进运动，兴奋兔离体肠平滑肌；并且胃肠舒无明显副作用，比单味中药更切合临床实际，比汤剂更方便。本研究在离体胃肠平滑肌细胞模型上进一步探讨了胃肠舒的促胃肠动力的作用及其机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  标准SD大白鼠由烟台绿叶实验动物中心提供；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司； Rhodamine(若丹明)123购自 Sigma公司；CellTiterGloTM 试剂盒购自Promega公司；Labsystems Multiskan MS酶标仪；HERA CO2培养箱；CK×41倒置显微镜、IX71荧光倒置显微镜购自OLYMPUS； EPICS XL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  离体胃肠平滑肌细胞的培养：选择标准SD大白鼠，体重180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重复清洗2～3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20～30 min。待小块组织完全消化溶解后，过200目网，1 000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制的20%胎牛血清DMEM培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37 ℃孵箱里静置培养待测，CK×41倒置相差显微镜观察拍照。

　　1.2.2  胃肠平滑肌细胞的鉴定：将处理好的盖玻片，放入6孔板使之与孔底贴和紧密，进行细胞培养。细胞生长至第5天吸去培养液，先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2～3次。95%酒精室温固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX100室温孵育20～30 min增强细胞通透性。正常羊血清于37 ℃封闭20 min。滴加一抗兔抗鼠αactin单克隆抗体（1∶200，购自Sigma公司）室温过夜，滴加二抗羊抗兔FITCIgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置荧光显微镜（波长500 nm）观察。

　　1.2.3  胃肠平滑肌细胞实验分组：实验分为5组，分别为空白对照组、胃肠舒小剂量组Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒中剂量组Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒大剂量组Ⅲ组（75 mg/ml）、西沙必利组（0.51 mg/ml），每组6个复孔，各组药物作用24 h。

　　1.2.4  胃肠平滑肌细胞ATP含量检测：CelltiterGloTM 试剂盒A液和B液混合，室温下静置1 h。向96孔板的各孔细胞中每孔加入100 μl CelltiterGloTM混合液，5 min后酶标仪检测（波长562 nm）。

　　1.2.5  胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的检测：将待测胃肠平滑肌细胞离心1 000 r/min收集，PBS清洗2次，加入1 ml的终浓度为1 μg/ml 的Rhodamine123，放入37 ℃孵箱里静置培养45 min。PBS清洗2次，倾去原有液体。250 μl PBS重悬，缓慢加入-20 ℃乙醇750 μl，流式细胞仪检测（激发波长488 nm、发射波长525 nm）。

　　1.3  统计学处理  组间比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  光镜观察胃肠平滑肌细胞  倒置显微镜下观察可见细胞形状椭圆形，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状，峰处为多层细胞，谷处为单层或双层细胞，培养4 d后细胞铺满培养瓶瓶底。见图1。

　　A是正常培养2 d的胃平滑肌细胞， A′是正常培养2 d的肠平滑肌细胞；B是正常培养4 d的胃平滑肌细胞， B′是正常培养4 d的肠平滑肌细胞。

　　图1  光镜下观察离体培养的胃肠平滑肌细胞模型（×200）（略）

　　2.2  胃肠平滑肌细胞的鉴定结果  为确定胃肠平滑肌细胞离体分离培养成功，用兔抗鼠αactin单克隆抗体进行了鉴定，细胞经漂洗后置于荧光显微镜下观察，负载FITC的细胞经500 nm的波长激发下产生荧光，可见95% 以上的细胞显示阳性荧光标记，说明离体培养的平滑肌细胞成功。

　　2.3  胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞ATP的影响  ATP是细胞内能量的主要存在形式，是平滑肌细胞的直接能量来源，细胞内ATP的水平能够反映平滑肌细胞的运动能力。用虫荧光素酶-荧光素系统测定细胞或组织中ATP的含量是目前生物能量研究中最灵敏最专一的方法之一。本实验采用CelltiterGloTM 试剂盒检测了不同剂量胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞ATP含量的影响，结果表明胃肠舒片作用24 h后能显著增高平滑肌细胞ATP的含量，随着胃肠舒用药浓度的增加改变ATP的含量也加大，ATP的改变量与正常对照组和西沙比利组进行t检验，P<0.05。见图2。
 
　　图2  胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞ATP的影响（略）

　　2.4  胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响  Rhodamine 123可以通透细胞膜，选择性染色活细胞线粒体，是一种广泛用作检测线粒体跨膜电位的荧光探针，流式细胞仪检测结果（图3）显示，胃肠舒组细胞荧光分析图与对照组相比右移，表示线粒体跨膜电位上升，胃肠舒实验组明显比空白对照组增大线粒体的跨膜电位，比西沙必利组改变线粒体跨膜电位的幅度也大，并且随着胃肠舒用药浓度的增高，胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位随之增加。

　　图3  胃肠舒片对胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响（略）

　　3  讨论
   
　　从中医学观点看胃肠运动障碍型疾病，多由于脾胃功能失调、升降失司、气机不畅所致，治疗重在调理脾胃功能、协调升降、舒畅气机。本研究的项目胃肠舒片方中大黄通胃肠腑气，泻胃肠积滞为君药；枳实行气消胀，破积除满为臣药；甘草健脾益气，甘缓和中，调和诸药，防大黄攻下伤正为佐使。故诸药相互配伍，具有调和脾胃升降，疏通胃肠气机的功效，使肠胃升降功能得以恢复而达到治疗目的。
   
　　从现代医学观点看，胃肠运动障碍型疾病多由胃肠运动功能失调，能量供应不足导致胃排空时间延长所致。线粒体是真核细胞能量转换的主要场所，是细胞生成ATP的主要地点［1］。线粒体基质的三羧酸循环酶是通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜电位合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程［2～5］。因此线粒体跨膜电位和ATP的变化直接影响着细胞的动能，继而会影响到相应组织的运动能力。通常线粒体跨膜电位和ATP水平的升高表明线粒体功能增强，能量供应充足，动能增加，细胞/组织运动能力加强。本实验流式细胞仪检测结果显示中药胃肠舒实验组与空白对照组和西沙必利组相比，其荧光分析折线图明显右移，线粒体跨膜电位大大增加，与此同时，其ATP的含量也明显增加。并且线粒体跨膜电位和ATP增加的幅度与胃肠舒的用药浓度成正比关系。当然，胃肠道神经系统对胃肠运动功能的调节支配较为复杂，目前已知［6～9］胃肠道神经系统中最主要的兴奋性神经递质是乙酰胆碱（acetylcholine ，ACh），最主要的抑制性神经递质是一氧化氮(NO)，有研究表明乙酰胆碱和一氧化氮之间在调节胃肠动能时存在着精细的平衡，当失去平衡尤其是NO增加而乙酰胆碱减少时，能引起线粒体跨膜电位和ATP的变化，导致胃肠运动功能障碍。本实验中胃肠舒对这两类神经递质是否有影响以及如何影响正在进一步的实验确认中。
   
　　本项目对于阐释中药促进胃肠动力的作用机制提供了科学的实验数据，为开发胃肠动力中药新药开辟了新的思路，奠定了坚实的实验理论基础，意义重大。

【参考文献】
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基金资助项目：国家自然科学基金资助项目(30672680)

作者单位：滨州医学院基础学院 滨州市 256603；滨州医学院临床学院