点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨c-myc和MMP-9在骨髓增生异常综合征（MDS）恶性转化中的意义。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测c-myc mRNA和MMP-9 mRNA在MDS低危（RA, RARS）、高危（RAEB，RAEB-t）及MDS-AML变组患者骨髓单个核细胞中的表达，并与10例正常对照进行比较。结果 MDS高危组、MDS-AML变组c-myc表达高于MDS低危组及正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），高表达c-myc的MDS患者易转化成急性白血病。MMP-9在MDS中的表达与正常对照差异无统计学意义（P＞0.05），但3例骨髓原始细胞数在70%以上的MDS-AML变患者骨髓仍高水平表达MMP-9。结论 c-my在MDS的发展、转化过程中起重要作用，并对判断预后有一定的临床意义；MMP-9在MDS恶性转化中的作用有待进一步研究。
【关键词】 骨髓增生异常综合征；c-myc基因；基质金属蛋白酶-9；美法仑
Expression and significance of c-myc and MMP-9 in myelodysplastic syndromes progression
HUANG Yanxin1 YE Ling2
1 Shandong Academy Medical Sciences，Ji’nan 250062；2 Affiliated First Hospital of Jining Medical College
【Abstract 】 Objective To investigate the role of MMP-9 and c-myc in the transformation from myelodysplastic syndromes(MDS) to acute myeloid leukemias(AML). Methods The expression of MMP-9 and c-myc in bone marrow mononuclear cells (BM-MNCs) of patients with low-risk stage of myelodysplastic syndromes（RA, RARS），high-risk stage of myelodysplastic syndromes（RAEB，RAEB-t） acute myeloid leukemia secondary to MDS and normal control were examined by using the revert transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)method.Results The expression level of c-myc in BM-MNCs of patients with RAEB or RAEB-t were significantly higher than that in RA or RARS（P＜0.05）,and displayed an increasing tendency with transformation to leukemia. The expression level of MMP-9 mRNA had no significant changes（P＞0.05）, however three patients with acute myeloid leukemia secondary to MDS,in which the ratio of blast cells exceed 70% , also presented high expression level of MMP-9.Conclusion c-myc may play an important role in myelodysplastic syndromes progression，however，the role of MMP-9 remains to be studied further.
【Key words】 myelodysplastic syndromes,c-myc gene,matrix metalloproteinases-9,melphalan
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性克隆性疾病，其基本病变为造血干/祖细胞发育异常和高风险向白血病转化。原癌基因c-myc作为调控细胞增殖的关键基因之一，其过度表达参与多种肿瘤的发生，而MDS的发病与细胞凋亡及增殖的异常改变有关。基质金属蛋白酶9（MMP-9）主要功能之一是降解细胞外基质，骨髓微环境中MMP-9与细胞外基质相互作用的紊乱可以破坏造血细胞内环境的稳定，影响造血细胞的生长、增殖、分化和正常功能的发挥。我们用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了MDS患者骨髓单个核细胞c-myc基因和MMP-9的表达，探讨二者在MDS恶性转化过程中的表达及意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 所有病例来自山东大学齐鲁医院血液肿瘤中心、山东省千佛山医院、济南军区总医院、济宁市第一人民医院2004年10月—2007年5月的住院患者。MDS患者23例，男13例，女10例；年龄54～75岁，中位年龄62岁。其中难治性贫血（RA）6例，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞（RAS）5例，难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）5例，难治性贫血伴原始细胞增多转变型（RAEB-t）7例；将RA和RAS分入低危组，RAEB和RAEB-t分入高危组，所有患者均为初治；MDS转化的急性白血病7例，诊断标准见文献［1］。正常对照10例，年龄25～55岁，中位年龄33岁，均为健康志愿者。所有患者均给予支持治疗。低危患者首选免疫抑制剂，如环孢素A、沙利度胺等；高危组且年龄＜75岁不适合AML样化疗者，给予美法仑口服（2 mg/d,连服2～4个月），年龄＜55岁的高危和MDS-AML变患者给予AML方案化疗，如DA方案（柔红霉素+阿糖胞苷）、TA方案（拓扑替康+阿糖胞苷）等。
1.2 试剂与仪器 PTC-150型PCR扩增仪为美国MJ Research公司产品，EC250-90多功能电泳仪为美国EC公司产品，ID Image Analysis software 凝胶分析系统为美国Kodak公司产品，RT-PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1．3 实验方法
1．3.1 标本采集：均在无菌条件下抽取骨髓液3～4 ml，注入EDTA抗凝试管中，加入4ml PBS（pH7.4）缓冲液稀释。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞，－80℃保存备用。
1．3.2 总RNA提取：分别将上述收获的MDS患者骨髓单个核细胞按相同比例混合，加入Trizol(Invitrogen,USA)试剂，按照公司提供的步骤进行总RNA的提取。RNA的浓度及质量通过1％的琼脂糖凝胶电泳测定。
1．3.3 引物：引物由上海生工生物工程公司合成。
c-myc引物序列：
P1 5′-GATTCTCTGCTCTCCTCGAC-3′，P2 5′-TCCAGACTCTGACCTTTTGC-3′，扩增产物180 bp。
MMP-9引物序列：
P1 5′-GAGATGCGTGGAGAGTCGAA-3′，P2 5′-CCGAGTTGGAACCACGACGC-3′，扩增产物489 bp。
GAPDH引物序列：
P1 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，P2 5′-CATCTCTTGCTCGAA-3′，扩增产物317 bp。
1．3.4 逆转录反应：于经DEPC处理过的0.5 ml Eppendor管中建立逆转录反应体系：细胞总RNA 1 μl，MMLV 1 μl，dNTP 1 μl，DTT 2 μl，5×buffer 4 μl，下游引物1 μl，去RNase水10 μl，2 000 r/min快速离心，混匀，37℃ 1 h，95℃ 10 min，灭活MMLV，2 000 r/min快速离心，使蒸气沉于管底。
1．3.5 聚合酶链反应：逆转录成功后，在上述20μl RT产物的0.5 ml Eppendorf管中，建立下列反应体系：dNTP 1μl，buffer 10 μl，MgCl2 28 μl，Taq polynase 2 μl，上游引物1 μl，超纯水（D.D.W）58 μl，快速离心混匀，95℃ 5 min，冰浴冷却，然后3 000 r/min快速离心，使蒸气沉于管底，加入2 μl TaqDNA聚合酶，3 000 r/min快速离心，加入60 μl液体石蜡油。94℃，1 min，58℃，1 min，72℃，1 min，共35个循环，最后72℃延长7 min。
1．3.6 定量分析：取10 μl PCR产物，于2%琼脂糖凝胶上电泳，电泳图像输入Kodak凝胶分析系统，应用ID Image Analysis software 进行表达强度分析，结果判断以同时扩增的内参照GAPDH的表达强度为基准，c-myc/GAPDH、MMP-9/GAPDH代表c-myc和MMP-9的相对表达量。
1.4 统计学处理 应用SPSS13.0数据统计软件分析实验结果。结果用x±s表示，采用独立样本t检验进行统计学处理，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2．1 c-myc基因在MDS和MDS-AML变患者中的表达结果见表1。MDS高危组、MDS-AML变组患者c-myc基因表达水平均明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MDS-AML变组c-myc基因表达高于MDS高危组，差异有统计学意义（P＜0.05）。MDS高危组、MDS-AML变组患者c-myc基因表达水平明显高于MDS低危组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MDS低危组c-myc基因表达水平高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 表1 c-myc基因在MDS不同临床阶段及对照组中的表达情况注：#与高危组比较P＜0.05；*与MDS-AML组比较P＜0.05；△与对照组比较P＞0.05；※与对照组比较P＜0.05
2．2 MMP-9在MDS和MDS-AML变患者中的表达结果见表2。MDS低危组、高危组、MDS-AML变组MMP-9表达与正常对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），MDS低危组、MDS高危组、MDS-AML变组间相比差异无统计学意义（P＞0.05）。但3例骨髓原始细胞数在70%以上的MDS-AML变患者骨髓仍高水平表达MMP-9，平均表达水平为0.4168。表2 MMP-9在MDS不同临床阶段及对照组中的表达情况注：＃与高危组比较P＞0.05；※ 与MDS-AML组比较P＞0.05；△与对照组比较P＞0.05
2．3 c-myc、MMP-9表达在MDS恶性转化过程中的变化 对23例MDS患者进行了25个月的随访观察，1例RAEB16个月后转化为急性白血病，2例RAEB-t分别于7、20个月后转化为白血病，以上3例患者c-myc表达分别为0.4821、0.4933、0.5056，转化为白血病后c-myc表达分别为0.7031、0.7278、0.7234,差异有统计学意义（P＜0.05）。MMP-9表达在上述3例MDS转化为白血病前后变化差异无统计学意义（P＞0.05）。
2．4 初治MDS、MDS-AML变患者c-myc、MMP-9表达与治疗的关系 RAEB 2例，RAEB-t 3例，MDS-AML 2例，口服小剂量美法仑2 mg/d，连用2月，达CR 2例，NR 1例。RAEB-t 4例，MDS-AML 5 例用DA或TA方案化疗，达CR 4 例，NR 5 例。CR患者c-myc平均表达水平为0.1524，NR患者c-myc 平均表达水平为0.6193，差异有统计学意义（P＜0.05）。CR患者MMP-9平均表达水平为0.3961，NR患者MMP-9表达水平为0.4116。差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
MDS是一组造血干细胞克隆性疾病，以骨髓病态造血、外周血细胞减少和高风险向急性白血病转化为特征。MDS发展过程中凋亡受抑和过度增殖，使异常增生的单克隆造血进一步恶变而向急性白血病转化。原癌基因c-myc作为调控细胞增殖的关键基因之一，在调控细胞增殖中起关键作用，其过度表达可刺激细胞周期进程，引起细胞转化，可促进多种肿瘤的发生。Felsher等［2］研究证实，c-myc的表达导致髓系和淋巴系恶性肿瘤的形成，一些肿瘤的形成要求初始的c-myc基因的损伤。我们用RT-PCR方法对MDS和MDS-AML患者骨髓单个核细胞c-myc基因的表达进行了研究，结果显示，MDS高危组、MDS-AML变组c-myc表达水平明显高于正常对照和MDS低危组，MDS-AML变组明显高于MDS高危组，初步提示c-myc表达增高与MDS的病情进展及转化有关，这与陈萍等［3］的研究报道一致。同时发现MDS高危组患者转化为白血病后c-myc表达水平明显升高，MDS-AML患者经治疗CR后c-myc水平明显下调，因此，c-myc可能对预测MDS的演变和判断化疗疗效有一定意义。
基质金属蛋白酶-9（MMP-9）可降解形成基膜结构的明胶和Ⅳ、Ⅴ型胶原及弹性蛋白等［4］。骨髓微环境中MMP-9与细胞外基质相互作用的紊乱可以破坏造血细胞内环境的稳定，影响造血细胞的生长、增殖、分化和正常功能的发挥。正常情况下，在造血细胞中基质金属蛋白酶-9的合成开始于髓系分化的后期阶段［5］。研究［6］发现，急性髓系白血病原始细胞和白血病细胞株K-562、KG-1、HEL、HL-60均可过早合成MMP-9。本研究结果显示，但是3例骨髓原始细胞数在70% 以上的MDS-AML变患者仍高水平表达MMP-9 mRNA，提示MDS患者骨髓原始细胞中也存在过早合成MMP-9的现象，MMP-9可能与MDS的恶性转化有一定联系。
Omato等［7］首次报道小剂量美法仑可以有效治疗高危老年MDS患者而且具有毒性作用小、骨髓抑制轻的优势。Robak等［8］用小剂量美法仑治疗8例MDS和15例急性髓系白血病伴多系增生异常患者，4例获CR，3例PR，中位总剂量为120 mg。国内也有单用小剂量美法仑成功治疗老年高危低增生MDS的报道［9］。本次研究中，高危组且年龄＜75岁不适合AML样化疗者，其中MDS-RAEB 5例，MDS-RAEMB-t 6例，给予口服小剂量美法仑（2 mg/d,连服2～4个月）治疗,2例达CR，3例达PR，所有患者均未出现明显不良反应。提示小剂量美法仑可能是一种有效的治疗方法，尤其适用于一般状况差的老年患者。但由于病例数量有限，尚不能得出肯定性结论，仍有待于收集大量病例进行对照研究，并进一步探讨疗效与骨髓增生程度、细胞遗传学及分子生物学改变的关系。
【参考文献】
［1］ 张之南, 沈悌. 血液病诊断及疗效标准［Ｍ］.第2版.北京：科学出版社，1999:171-173.
［2］ Felsher DW,Bishop JM. Reversible tumorigenesis by MYC in hematopoietic lineages［J］. Mol Cell, 1999,4(2):199-207.
［3］ 陈萍，丛雅琴，李丽珍. PTTG、c-myc基因在骨髓增生异常综合征中表达的研究［Ｊ］. 山东医药, 2004，44（31）:8-9.
［4］ 张树平,王桂花，王垣芳，等.大鼠局灶脑缺血基质金属蛋白酶-2的表达［J］.滨州医学院学报，2007，30（4）：247-249.
［5］ Borregaard N, Cowland B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte［Ｊ］. Blood,1997,89(10):3503-3521.
［6］ Janowska-wieczorek A,Marquez LA,Matsuzaki A,et al.Expression of matrix metalloproteinase(MMP-2 and MMP-9 ) and tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMP-1 and TIMP-2) in acute myelogenous leukaemia blast:comparision with normal bone marrow cells［J］.Br J Haematol, 1999,105(2):402-411.
［7］ Omoto E, Deguchi S, Takaba S,et al. Low-dose melphalan for treatment of high-risk myelodysplastic syndromes［J］.Leukemia,1996,10(4):609-614.
［8］ Robak T, Szmigielska-Kap，Urbańska RH. Efficacy and toxicity of low-dose melphalan in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia with multilineage dysplasia［J］.Neoplasma, 2003,50(3):172-175.
［9］ 徐泽锋,邹煦,肖志坚. 单用小剂量马法兰成功治疗老年低增生性RAEB-Ⅱ型一例［Ｊ］.中华血液学杂志,2003，24（3）：148.
作者单位：1 山东省医学科学院 济南市 250062；2 济宁医学院附属第一人民医院