阿魏酸钠对兔急性心肌梗死再灌注后无复流的影响

【摘要】  目的 探讨阿魏酸钠对兔急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI )再灌注后无复流的作用及机制。方法 随机将24只成熟雄性新西兰大白兔分为假手术组、对照组、阿魏酸钠组3组，每组8只，分别建立AMI缺血再灌注模型，于缺血前5min、结扎后240 min，再灌注后120 min取静脉血。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清白介素6（IL6）；免疫组织化学法观察心肌组织P选择素（Ps）的变化；应用硫黄素染色评估无复流面积。结果 ①对照组和阿魏酸钠组AMI后240 min、再灌注后120 min的血清IL6均显著高于假手术组(P均＜0.01)；阿魏酸钠组各时间点除AMI前血清IL6均显著低于对照组(P均＜0.05)。②Ps免疫组化显示，对照组及阿魏酸钠组中，Ps在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组（P均＜0.01）；阿魏酸钠组与对照组比较，Ps在复流区及无复流区表达均明显减弱（P均＜0.01）。③病理染色分析示，阿魏酸钠组结扎区心肌范围与对照组相比差异无统计学意义（P均＞0.05）；无复流区心肌范围与对照组相比显著降低(P均＜0.01 )。结论 阿魏酸钠能有效抑制炎症反应，防治AMI再灌注后无复流。

【关键词】  阿魏酸钠；炎症；白介素6；P选择素；无复流

Effect of sodium ferulate on  noreflow in a rabbit model of acute myocardial infarction and reperfusion

    DING Lingyan  LIU Xianliang  ZHAO Xijun  et al

    Department of Cardiovascular Medical，Affiliated Hospital of  Binzhou Medical University,Binzhou  256603

    【Abstract】  Objective   To evaluate effects of sodium ferulate on noreflow phenomenon in a rabbit model of acute myocardial infarction and reperfusion.Methods  Twentyfour mature male rabbits were randomly divided into shamoperated group，control group，sodium ferulate group with 8 in each group. The later groups were subjected to 240 minutes of left circumflex coronary artery (LCX) occlusion followed by 120 minutes of reperfusion. The serum levels of IL6 were measured by ELISA;To observe myocardial Pselectin (Ps) by immunohistochemical (IHC) method. The area of noreflow was evaluated with pathological means.Results  ①Compared with the shamoperated group,  IL6 in blood sample in control group and sodium ferulate group increased significantly at the end of 240 min of LCX occlusion and 120 min of reperfusion (all P＜0.01); In each time point but before AMI IL6 in blood in sodium ferulate group was lower significantly than that in control group (all P＜0.05). ② In  control and sodium ferulate groups, it was showed by IHC that Pselectin powerfully expressed in vascular endothelial cell of reflow and noreflow myocardium, and more powerfully than normal myocardium and shamoperated groups（all P＜0.01）;In sodium ferulate group, its expression in reflow and noreflow myocardium attenuated significantly than that in control group（all P＜0.01 ）.③Between sodium ferulate group  and control group, there was no significant diference in coronary ligation area (P＞0.05);The area of noreflow of  sodium ferulate group ,decreased significantly compared with  control group(P＜0.01 ).Conclusion  Sodium ferulate is effective in antiinflammation and preventing myocardial noreflow in  rabbit with acute   myocardial infarction and reperfusion.

    【Key words】  sodium ferulate,inflammation,interleukin6,Pselectin,noreflow

    无复流是指急性心肌梗死（AMI）冠脉再通后，心肌组织再灌注不完全，甚至出现无再灌注。中性粒细胞、纤维蛋白血栓、血小板的聚集，内皮细胞肿胀等因素造成微循环障碍是无复流现象的重要标志［1］。炎症在缺血性心脏病的发生与发展中起着关键作用［2］。因此，近年来，从免疫学的角度来研究心肌缺血再灌注损伤已成为一个热门课题。本实验通过观察应用阿魏酸钠后血清IL6、心肌组织P选择素(Ps)表达及无复流区心肌范围的变化，探讨其对AMI再灌注后无复流的作用及机制。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象与分组  新西兰大白兔24只，健康雄性，体重2.5～3.0 kg，应用随机排列表分成三组：正常对照组、假手术组、阿魏酸钠组，每组8只。阿魏酸钠组(25 mg/kg , 缺血前30 min由兔耳缘静脉持续滴注)。

    1.2  动物模型的制作  以30 g/L戊巴比妥钠1 ml/kg（30 mg/kg）经耳缘静脉注射麻醉，沿胸骨左缘第3～4肋间打开胸腔，纵行切开心包膜，暴露心脏，并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮状, 于冠状动脉左回旋支(LCX)远端1/3～1/2处进行结扎，建立AMI模型。240 min后放松结扎线120 min，以使冠状动脉再通形成再灌注，即缺血再灌注模型。对照组及阿魏酸钠组结扎240 min，再松解120 min，分别建立AMI及再灌注模型。 假手术组冠脉下只穿线，不结扎，无AMI，也无再灌注。

    1.3  模型制作成功判定方法  血管结扎后供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5 mV，局部心肌变成紫红色并有节段性运动不良，证实闭塞有效，松开结扎前后STT下降1/2以上，局部心肌变红，为缺血再灌注模型成功。

    1.4  心肌病理染色及区域划分  再灌注后，按1 ml/kg从左心房注入硫黄素，使复流区着色，无复流区不着色；再于原位重新结扎LCX，从左心房再注入Evan's蓝，使结扎区外着蓝色，结扎区不着蓝色。立即取出心脏，沿心脏长轴分为5～6心肌短轴切片，结果非结扎区心肌呈蓝色，结扎区在紫外线（波长365 nm）下无复流区不显色，有复流处显色。对切片拍照，计算出左心室室壁心肌面积、结扎区(无蓝色)心肌面积及无复流区(紫外线下不显色)面积；同样依结扎区心肌面积/左心室室壁心肌面积计算出结扎区心肌范围(ligation area , LA)，依无复流区面积/结扎区心肌面积计算出心肌无复流心肌范围(area of noreflow, ANR)。

    1.5  血液样本及心肌组织Ps的采集及测定  三实验组分别于结扎前5 min、结扎后240 min、再灌注后120min抽取静脉血2 ml。注入2 ml放入普通试管中，离心取血清-20℃保存待检。

    采用ELISA测定血清IL6, 具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

    取各区域心肌标本用40 g/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋, 常规制片,免疫组化法测定各区域心肌组织中的Ps表达水平。

    1.6  统计学处理  实验数据以x±s表示，采用SPSS11.5进行统计学处理，多个样本均数的比较用方差分析，两样本均数的比较用t检验。P＜0.05为统计学差异有显著性。

    2  结果

    2.1  阿魏酸钠对兔AMI再灌注后血清IL6的影响  AMI前各组血清IL6水平无显著差异(P均＞0.05) ；对照组和阿魏酸钠组AMI后240 min、再灌注后120 min的血清IL6均显著高于假手术组(P均＜0.01 )；与AMI前比较显著升高, 且呈递增趋势(P均＜0.01) 。阿魏酸钠组各时间点除AMI前的血清IL6均显著低于对照组(P均＜0.05)。表1  各组在各时间点的血清IL6水平  注：与假手术组比较，*P＞0.05；与 AMI前比较，△P＜0.01；与AMI后240 min比较，▲P＜0.01；与对照组比较，■P＜0.05。

    2.2  心肌Ps免疫组化结果  对照组及阿魏酸钠组中，Ps在复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组（P均＜0.01）；无复流区表达强于复流区（P＜0.01）。阿魏酸钠组与对照组比较，Ps在复流区及无复流区表达均明显减弱（P ＜0.01）。表2  各组在各区域心肌组织Ps的IOD值分析注：IOD指积分光密度。与假手术组比较，□P＞0.05，▲P＜0.01；与正常区比较，△P均＜0.01；与复流区比较，■P＜0.01；与对照组比较，●P＜0.01；

    2.3  阿魏酸钠对兔AMI再灌注后心肌无复流范围的影响(图1～4)  阿魏酸钠组与对照组相比，LA差异无统计学意义（P均＞0.05），ANR显著降低(P均＜0.01 )。表3  各组结扎区及无复流范围的比较注：LA为结扎区心肌范围，ANR为无复流心肌范围。与对照组比较，▲P＞0.05，●P＜0.01   

    3  讨论

    3.1  阿魏酸钠对兔AMI再灌注后血清IL6的影响  研究发现，在心肌缺血再灌注损伤过程中，炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程。IL6是一种具备多重功能的细胞因子，Helmy等［3］认为在心肌缺血再灌注中IL6比C反应蛋白或肌酸激酶更敏感，可视为应激反应及心肌损伤程度的重要指标。本实验中，与AMI前比较, 对照组及阿魏酸钠组AMI后240 min、再灌注后120 min的血清IL6水平均显著升高, 且呈递增趋势。这提示缺血及再灌注损伤均诱发血清IL6的生成与释放。阿魏酸钠组除AMI前外各时间点的血清IL6水平均显著低于对照组，这提示阿魏酸钠能有效降低血清IL6。喻东亮等［4］对体外循环(CPB) 术前应用阿魏酸钠是否减轻肺缺血再灌注损伤研究中，证明CPB 手术前使用阿魏酸钠可有效的抑制炎症反应，减轻肺组织缺血再灌注损伤。

    3.2  阿魏酸钠对兔AMI再灌注后心肌组织Ps的影响  Ps是黏附分子选择素家族成员之一，在人体大多数组织如心、肝、肺、结肠、肾的血管内皮及血小板上表达，但含量低，主要分布于静止血小板的α颗粒和内皮细胞中。当受到缺氧、自由基、凝血酶、腺苷二磷酸等的刺激后，即活化并释放炎性递质，参与炎症过程。本实验发现，Ps在对照组复流区及无复流区血管内皮细胞有强表达，明显强于正常区及假手术组。提示缺血再灌注后Ps生成释放增多。而阿魏酸钠组与对照组相比，同一区域Ps的表达明显降低，提示阿魏酸钠可显著降低Ps的表达。

    3.3  阿魏酸钠对兔AMI再灌注后心肌无复流的影响  AMI再灌注后无复流现象产生的核心机制是由于微血管结构和功能的完整性损伤或破坏，炎症、血小板及粒细胞引起的微血管的填塞，内皮肿胀及氧化应激都可能起一定的作用［5］。本实验中，对照组兔AMI 240 min、再灌注120 min后出现了明显无复流，其范围达83.9％；值得注意的是，阿魏酸钠组能使ANR降至57.5%,比对照组低约26%,提示阿魏酸钠能显著减少兔急性心肌梗死再灌注后ANR。此外，有研究提示药物剂量与ANR呈量效关系［6］，而大剂量阿魏酸钠是否能使ANR降低更显著，有待于进一步研究。阿魏酸钠能有效防治无复流的机制尚不完全清楚,除抑制炎症反应外，尚可能与其抑制血小板聚集［7］，拮抗内皮素1作用，抑制自由基的生成和清除氧自由基，产生药理性缺血预适应［8］有关。

【参考文献】
  1］ Kloner RA, Rude RE, Carlson N,et al.Ultrastructural evidence of microvascular damage and myocardial cell injury after coronary occlusion［J］.Circulation, 1980, 62(5): 945952.

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［3］ Helmy SA, Wahby MA, ElNawaway M. The effect of anaesthesia and surgery on plasma cytokine production［J］.Anaesthesia, 1999, 54(8):733738.

［4］ 喻东亮，詹锋， 徐建军，等.阿魏酸钠对体外循环肺保护作用的研究［J］.中华胸心血管外科杂志，2005，21（4）:133134.

［5］ Herrmann J. Periprocedural myocardial injury: 2005 update［J］.Eur Heart J,2005,26:2493519.

［6］ 杨跃进，赵京林，孟亮，等. 中药通心络(超微粉碎)对猪急性心肌梗死再灌后无再流的影响［J］.中国中西医结合杂志，2006，1（26）：4953.

［7］ Taylor A J ，Bobik A ，Richards M ，et al.Myocardial endothelin1 release and indices of inflammation during angioplasty for acute myocardial infarction and stable coronary artery disease［J］.Am Heart J,2004,148(2):1013.

［8］傅颖君,何明.阿魏酸钠对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制［J］.药学学报,2004,39(5):325327.

作者单位：1 滨州医学院附属医院心内科 滨州市 256603；2 滨州医学院附属医院核医学科； 3 滨州医学院附属医院中心实验室