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摘要:目的 探讨荧光PCR法检测大肠癌患者外周血中CK20的表达情况并分析其与微转移的关系。 方法 运用荧光RT-PCR技术对大肠癌患者外周血CK20的表达进行检测。 结果 40例大肠癌患者外周血中检出CK20表达的有26例，检出率为65%。 结论 运用荧光RT-PCR技术检测外周血中CK20的表达可以监测癌症微转移的发生，适于临床推广。
关键词:大肠癌;荧光PCR;细胞角蛋白20
Study on the expression of cytokeratin20in peripheral blood of colorectoal carcinoma patients by using fluorescence RT-PCR.
GUO Jian-ping，Zhang Yang-de.
（Yuebei People's Hospital of Shaoguan City，Shaoguan512025，Guangdong，P.R.Chi-na）
Abstract:Objective To study the expression of cytokeratin20in peripheral blood of colorectoal carcinoma patients and explore its association with the metastasis of colorectal carcinoma. Methods The expression of cytokeratin20in the peripheral blood in the colorectal carcinoma patients was determined by using fluorescence RT-PCR. Results Cytokeratin20was expressed in26out of the40colorectal carcinoma patients with detection rate of65%. Conclusion Fluorescence RT-PCR was useful for detection the expression of cytokeratin20in peripheral blood fo colorectal carcinoma patients and monitoring the metastasis of colorectal carcinoma，thus it is worthwhile to recommended for climical application.
Key words:Colorectal carcinoma;Fluorescence RT-PCR;Citokeratin20.
转移是恶性肿瘤的一个重要标志，是肿瘤手术后复发、放疗和化疗失败的主要原因，也是肿瘤患者治愈率得不到提高的主要影响因素。据统计，约有50%的大肠癌患者在术后5年内死于局部复发或远端转移。近年研究表明，CK20目前已成为判断大肠癌转移的一个重要的判别指标 ［1］ 。本研究运用荧光PCR技术检测外周血中CK20的表达，进行大肠癌细胞微转移的临床运用研究。
1 对象与方法
1.1 样本 40例大肠癌患者，平均年龄42.5岁。其中，男性患者21例，女性患者19例，并进行了病理学检测和Dukes分期。抽取其外周静脉血4ml，用于CK20的表达检测。另抽取4名健康人外周血4ml作为正常对照。
1.2 CK20表达检测
1.2.1 总RNA提取 按Chomczynski和Sacchi ［2］ 介绍的方法抽提总RNA，在分光光度计上检测OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度及浓度。
1.2.2 RT-PCR 取1μg总RNA加入总体积为20μg含有20mMTrisHCl（pH8.3），50mMKCl，2.5mMMgCl 2 ，100pmol随机引物，50U AMV反转录酶的PCR管中，按Life Technologies反转录试剂盒提供的操作说明合成cDNA.取10μl合成的cDNA溶液进行荧光PCR反应。采用上海博亚生物技术有限公司合成荧光引物，以β-actin作为内对照。序列见表1。两对引物中的上游引物的5'端均用6-FAM荧光染料标记。PCR反应体系:逆转录产物10μl，25Mm MgCl 2 4μl，10×PCR反应缓冲液8μl，TaqDNA酶1μl（5u），引物20pmol，补DEPC处理过的水至终体积100μl。反应条件:预变性，94℃5min;变性，94℃1min;退火，60℃1min，延伸，72℃1min30个循环;最后72℃延伸7min。PCR产物使用GeneScan-350作为分子量标准在377测序仪上电泳跑胶检测。采用GeneScan3.0软件及Genotype2.1软件收集并分析结果。表1 CK20检测采用的引物序列（略）
2 结果
PCR产物分析，在40例患者中，检测出26例有CK20表达，检出阳性率为65%。研究还发现，CK20阳性检出与大肠癌分化程度差异无显著性（P>0.05），但与Dukes分期差异有显著性（P<0.05），统计结果见表2。表2 CK20在不同分化和Dukes分期的表达情况（ 略）
3 讨论
微转移是指用常规病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移。微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团的形式存在。临床转移一般都由微转移发展而来，而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步 ［3］ :（1）微量肿瘤细胞自原发灶脱离;（2）适应新代谢环境，逃避机体免疫:（3）侵袭远处组织;（4）在新组织中新生血管形成，肿瘤生长。精确肿瘤分期、判断预后以及准确评估癌局部区域的播散程度在预后和治疗上都非常重要。以往的评估方法常基于局部淋巴结的组织学检查，但存在因取材不当或细胞形态学证据不足而漏掉很小的转移癌灶等缺陷 ［4］ 。研究表明，大肠癌病人外周血中癌细胞具有较高的微转移率，即使是DukesA期病人，也有微转移的存在。临床可根据大肠癌患者外周血中癌细胞的检出结果进行针对性化疗，既可避免部分病人因不必要的化疗所带来的毒副作用，又可使一些真正高危病人得益于化疗，从而有的放矢，特别是对于DukesA期患者，化疗的针对性尤为重要 ［5］ 。通过CK20的表达检测监测癌细胞的微转移已经被人们广泛的运用，但如何将这一方法更好的运用到临床，提高检出率是人们目前十分关心的一个问题 ［6］ ，荧光PCR是一项近年来发展的一项新的的技术，其产物激发的荧光通过特殊的系统收集信号，通过软件处理，其检测的灵敏读大大提高，较常规的检测方法灵敏度可提高近1000倍，很适合于肿瘤微转移的早期检测。随着现代医学的不断进步，这一方法很快就会在临床普遍运用推广。
参考文献:
［1］Johnson FW，Burchill SA，Selby PJ.The molecular detection of circular-ing tumor cells［J］.Br J Cancer，1995，72（2）:268～276.
［2］Chomczynski P，Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction［J］.Anal Biochem，1987，162:156～159.
［3］Raj GV，Moreno JG，Gomella LG.Utilization of polymerase chainreaction technology in the detection of solid tumors［J］.Cancer，1998，82（8）:1419～1442.
［4］ Gerhard M，Juhl H，kalthoff H.Specific detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in bone marrow aspirates by poly-merase chain reaction［J］.J Clin Oncol，1994，12（4）:725～729.
［5］Noguchi S，Aihara T，Nakamori S，et al.The detection of breast carci-noma micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse tran scriptase polymerase chain reaction［J］.Cancer，1994，74（5）:1595～1600.
［6］ Datta Yh，Adams PT，Drobyski WB，et al.Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse-transcriptase polymerase chain reaction［J］.J Clin Oncol，1994，12（3）:475～482.
作者单位:1.广东省粤北人民医院，广东韶关 512025;
2.中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙 410008.
作者简介:郭建平，男，硕士，副主任医师，主要从事肝胆外科及肿瘤研究.
收稿日期:2005-03-31