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【摘要】 目的 探讨大肠癌患者外周血微转移的检测和临床意义。方法 以非同位素RT-PCR方法，检测30例大肠癌患者术前和术后外周血中大肠癌细胞的标志物细胞角蛋白20（cytokeratin，CK20），同时检测20例健康者外周血作对照。结果 30例病人外周血中查出CK20阳性表达23例，阳性率76.67%，20健康者外周血均无CK20表达。CK20阳性检出与Dukes分期、淋巴结转移和肝转移存在差别有显著性，术后3天内外周血CK20阳性检出较术前多出2例。随访发现，外周血CK20扩增阳性者，术后发生肝转移的机会增加（33.3%）。结论 检测大肠癌患者外周血微转移癌细胞可提高大肠癌临床分期的准确性，帮助综合判断患者的预后，且可能有助于早期诊断大肠癌肝脏微小转移。
关键词 大肠肿瘤 外周血 微转移 细胞角蛋白20逆转录—聚合酶链式反应
Studies on expression of CK20in colorectal carcinoma and its clinical significance
Yuan Zhengqiang，Cao Jianlin，Chen Weiwei，et al.
Zunyi Hospital，Zunyi，Guizhou563002.
【Abstract】 Objective To study the detection of micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas.Methods Cytokeratin20（CK20）mRNA in peripheral blood of30patients with colorectal carcinoma was detected at various time points before and after operation and20normal by using non-isotope RT-PCR technique.Results The positive rate of CK20mRNA in peripheral blood was76.67%.The positive detection was significantly correlated with Dukes stage and lymph node metastasis and liver metastasis.There were more2positive cases in3days of postoperation.There was a higher probability of liver metastasis in positive cases after operation.Conclusion The detection of CK20in peripheral blood of patients with colorectal carcinoma may improve the accuracy of clinical stagˉing and early diagnosing liver micrometastasis.
Key words colorectal carcinoma peripheral blood micrometastasis cytokeratin20RT-PCR
大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其术后转移和复发是大肠癌患者死亡的重要原因。准确判断肿瘤有无转移及其转移的途径和范围，对大肠癌的临床诊断、治疗及预后判断有重要意义。但在常规病理检查“无淋巴结转移”的大肠癌DukesB期患者中，有近30%的患者5年内死于肿瘤复发或远处转移，提示可能有大肠癌微转移的存在 ［1］ 。随着对大肠癌转移规律的深入研究，依赖于分子生物学技术对大肠癌微转移的检测及其临床意义日益受到重视。本研究采用靶向细胞角蛋白20（CK20）基因mRNA的非核素逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，检测了30例大肠癌患者外周血中癌细胞，与20例健康者外周血作对照，探讨其与肿瘤复发和转移的关系。
1 材料与方法
1.1 病例资料 30例确诊大肠癌患者，其中男19例，女11例，年龄19～63岁，平均（40.4±18.5）岁。20例健康体检者中，男12例，女8例，年龄30～60岁，平均（45.7±15.3）岁。两组一般资料间差异无显著性，具有可比性。大肠癌患者分别于术前和术后从外周静脉采集血液标本10ml，对照组空腹采集外周静脉血10ml，用转速为4000g高速离心机离心30min，然后于-70℃的低温冰霜保存待测。
1.2 引物 按文献 ［2］ 基因序列，由军事医学科学院生物工程研究所合成。CK20正义:5′—CAGACACACGGTGAACTATGG—3′，反义:5′—GATCAGCTTCCACTGTTAGACG—3′;β 2 —MG正义:5′—ACCCCCACTGAAAAAGATGA—3′，反义:5′—ATCTTCAAACˉCTCCATAGTG—3′。
1.3 总RNA提取、cDNA合成RT-PCR 根据骆成玉等报道的方法 ［3］ ，设计β 2 —MG作为内参对照，以证实所提取RNA足量、完整、可比，β 2 —MG扩增产物（120bp）与CK20扩增产物（370bp）的电泳条带之间距离合适便于观察分析。PCR循环在美国Idaho1605型气浴PCR仪上进行，94℃7秒、55℃8秒、72℃20秒，共32个周期。反应产物取10μl行2%琼脂糖凝胶电泳、溴乙啶染色，紫外光下照相记录。
1.4 统计学方法 采用χ 2 检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 两组外周血检出CK20m RNA阳性表达情况 30例大肠癌患者中，外周血检出CK20mRNA阳性表达者23例，阳性率76.67%。对照组20例中没有阳性表达。CK20阳性检出与大肠癌分化程度差异无显著性（P>0.05），但与Dukes分期、肝脏转移、淋巴结转移间差异有显著性（P<0.05）。见表1。随着Dukes分期的进展，CK20阳性率显著增加，并且各期间差异有显著性（P<0.05）;CK20阳性的患者肝转移率显著高于阴性患者，两者差异有显著性（P<0.05）。
表1 大肠癌患者外周血CK20阳性检出率与对照组及临床病理之间的关系（略）
2.2 术后外周血CK20阳性检出情况 术后3天内外周血CK20阳性检出25例，较术前多2例。
2.3 随访情况 本组随访时间平均18.5±10.6（6～36）个月。术时肝转移阴性而外周血CK20阳性的18例中有6例出现肝转移（33.3%），术时肝转移和外周血CK20均阴性的7例患者中没有肝转移。
3 讨论
自1986年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移的概念在实践中逐步建立并引起重视。微转移一般是指非血液系统恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血液循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的微小瘤细胞灶，它可以是单个瘤细胞或独立的瘤细胞灶，无特殊血液供应，直径<2mm，常无任何临床表现，常规检查方法如CT、MRI及普通病理学检查都很难发现。研究认为，癌临床转移一般皆由微转移发展而来，微转移可以通过以下途径发展为临床转移 ［1］ :微量瘤细胞自原发灶脱落—在血循环及淋巴系统生长;免疫逃避—瘤细胞被远处脏器“搏获”;适应新环境—微血管形成，肿瘤生长。
CK20分布于上皮细胞的中间纤维丝，具有严格的上皮特异性分布，非上皮来源组织或细胞如正常血液、骨髓和淋巴结不表达CK20 ［4］ 。CK20是新近发现的细胞角蛋白成员之一，具有独特的分布特点和表达模式，是检测大肠癌微转移敏感、特异的良好标志物 ［5］ 。本文20例对照组外周血均 无CK20表达，所以，一旦大肠癌患者外周血中CK20阳性表达就提示癌细胞的存在。
本研究结果表明，大肠癌患者外周血中具有较高的微转移率（76.67%），即使是Dukes A期病人外周血微转移率也已高达25.0%，表明早期大肠癌也可能存在癌细胞血行播散。而且随着病情的发展，外周血中微转移明显增加，在Dukes A期微转移率为25.0%，在Dukes D期微转移率高达100.0%。因此，检测外周血中微转移癌细胞可提高大肠癌临床分期的准确性，并帮助综合判断患者的预后。更重要的是，该检测为确定术后治疗方案、指导辅助化疗提供了理论依据。特别是对于Dukes A期患者，化疗的针对性尤为重要，并不是Dukes A期的所有病人都不需要化疗，部分病人确需化疗。
术后3天内对患者外周血的检测发现较术前阳性检测增多了2例，提示手术增加了大肠癌微转移的机会。因此，手术过程中应严格执行不接触、隔离技术，最大限度地减少围手术“癌细胞医源性播散”的可能。
对本组患者的随访发现，术时肝转移阴性但外周血CK20扩增阳性的病例，术后发生肝转移机会增加（33.3%），其中2例分别在术后4个月和6个月出现肝转移;而术时肝转移和外周血CK20均阴性的7例患者中没有肝转移。提示外周血中CK20阳性表达的大肠癌患者可能具有肝转移倾向或术时就已经存在早期肝转移，只是裳未形成一定大小的肝脏微小转移灶。因此，外周血中CK20的检测可能有助于筛选大肠癌肝转移的高危病例或早期诊断大肠癌肝脏微小转移。
RT-PCR方法具有较高的敏感性，可以检测出浓度为10 6 ～10 7 的肿瘤细胞 ［6］ ，尤其适用于微量肿瘤细胞的检测。我们所用的非核素RT-PCR法简便快捷，避免了核素使用的多种限制，更易于推广应用。
我们认为，对外周血中癌细胞检测阳性的大肠癌患者应密切追踪随访，定期行肝脏B超、CT、MRI等检查，以尽可能早的发现患者肝内转移灶，使患者得到及时的治疗。并积极给予针对性辅助或补救性治疗，包括全身化疗、门静脉置管、手术切除等措施。在微转移时及时给予治疗，可能减少大肠癌患者术后复发和肝转移灶的形成。
参考文献
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（收稿日期:2004-04-17）
（编辑李 木）
作者单位:563002贵州省遵义医院
贵州遵义医学院附属医院