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【摘要】 目的 检测胃癌患者门静脉血细胞角蛋白20(CK20)mRNA,并探讨其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）方法检测30例胃癌患者和10例腹腔良性疾病患者术中门静脉血CK20mRNA。结果 胃癌组门静脉血CK20mRNA检出率53.3%（16/30），对照组门
静脉血CK20mRNA均为阴性。胃癌患者门静脉血CK20mRNA检出率与临床TNM期别、有无淋巴结转移相关（P<0.05），并与组织分化及肿瘤浸润深度密切相关（P<0.01）。结论 胃癌血行转移与有无淋巴结转移及TNM期别有关；与组织分化及浸润深度密切相关；有助于临床采取相应的治疗。
【关键词】 胃肿瘤;逆转录聚合酶链反应;细胞角蛋白20；转移
Detection of CK20mRNA in portal venous blood with gastric cancer and its clinical implication
XIANG He-ping, ZHANG Chang-le.
Department of Surgery, The Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Anhui 230000,China
【Abstract】 Objective To detect Cytokeratin20(CK20) mRNA in portal venous blood from patients with gastric cancer and to study its clinical significance. Methods Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the CK20mRNA in portal venous blood from 30 patients with gastric cancer and 10 patients with benign disease who underwent laparotomy served as controls.Results The positive rate of CK20mRNA in portal venous blood
was 53.3%, none of 10 patients with benign disease was positive. The positive rate of CK20mRNA in portal venous blood was correlated to the TNM classification and lymph node metastasis（P＜0.05），and also strongly correlated with the different gastric cancer cell line and the stage of the cancer (P＜0.01).Conclusion Metastasis in blood was correlated to lymph node metastasis and TNM classification, and also strongly correlated to the different gastric cancer cell line and the stage of the cancer; and it can be helpful to the therapy.
【Key words】 stomach neoplasm;reverse transcriptase-polymerase chain reaction;cytokeratin 20;metastasis
胃癌根治术后，血行转移是主要死亡原因之一,因此术前及术中早期检出血液中的癌细胞进而采取有效的阻断治疗，是提高疗效的关键，RT-PCR检测具有高度敏感性和特异性，可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞,被认为是目前检测微转移的最有效方法［1］。成功的肿瘤微转移的检测取决于是否具有适当的肿瘤标记物。细胞角蛋白20（CK20）由Moll［2］ 等于1990 年发现，含42 个氨基酸，分子量为48553 ，等电点为566 ，为酸性CK。不同于其他CK ，CK20 具有更为严格的上皮组织特异性，在正常组织中CK20 见于胃黏膜、幽门腺体细胞、十二指肠黏膜、肠黏膜、泌尿系伞状细胞、表皮MerKel 细胞，而其他组织如血液、淋巴、平滑肌、乳腺等均为阴性，且CK20 在细胞发生化生、癌变，肿瘤转移,体外培养等改变时，持续阳性表达［3，4］。检测胃癌患者血液中CK20 可作为癌细胞血液播散的标志，有助于判断胃癌患者有无血液转移。
1 资料与方法
1.1 临床资料 收集本院2003 年5月～2004 年5月收治的胃癌患者30 例为实验组，全部病例均经胃镜病理证实；术前检查无其他部位的恶性肿瘤；术前未接受放疗和化疗；全部病例均经手术切除治疗。收集本院同期住院开腹手术的良性疾病患者10 例，作为对照组。实验组男18例，女12例；年龄38～77 岁，平均年龄59.5 岁。
1.2 标本采集 于手术进腹后立即寻找到胃网膜右静脉，予以切开并置入导管至门静脉，抽取各5ml 门静脉血，立即以肝素抗凝存于-70℃低温冰箱中保存，留待检测血CK20mRNA 。所有器械均经0.1% DEPC 液浸泡24h去RNA 酶处理。
1.3 引物 根据GenBank核酸数据库CK20(X73502)：使用Primer Premier 5.0设计两对引物：CK20：目的基因扩增片段长280bp;sense：5’-GAACAGGCTCAGGACTATCT-3’;anti-sense：5’-CCACTGTAATATGCGGTAAG-3’;
β-actin：目的基因扩增片段长510bp;sense:5'- CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3' ;anti-sense: 5'-GATTTTCTGCGCAAGTTAGG-3';以上引物均由大连Takara公司合成。
1.4 实验方法 门静脉血（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，使用Tris试剂盒提取淋巴细胞总RNA，用mRNA纯化试剂盒分离门静脉血淋巴细胞CK20mRNA ，以CK20mRNA为模板，经逆转录得到cDNA进行扩增，反应参数为：94℃预变性5min，94℃1min，50℃1min，72℃1min，共32 个循环，最后72℃延伸15min。
1.5 结果判定 RT-PCR产物置1%琼脂糖凝胶电泳（5V/cm）观察结果，溴乙啶染色，紫外光下照相，RT-PCR部分电泳条带在280bp处有清晰、明亮条带者为阳性，无此条带者为阴性，应用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统3.3分析电泳结果。
1.6 统计学方法 所有资料均录入SPSS10.0统计软件包处理：四格表组间率的比主要采用Fish确切概率法，配对资料比较采用McNemar配对χ2检验，以P<0.05为差异有显著性的标准。
2 结果
2.1 门静脉血的CK20mRNA表达情况在30例胃癌患者中，CK20mRNA可检出16例,阳性率为53.3%。在对照组10例患者中，CK20mRNA检测均为阴性结果，未发现假阳性情况。胃癌患者及对照组门静脉血CK20mRNA 的RT－PCR结果见图1。
图1 略
2.2 门静脉血的CK20mRNA表达与胃癌病理特征之间的关系 门静脉血CK20mRNA检测结果表明血液中癌细胞的检出率不仅与临床TNM期别、有无淋巴结转移相关（P<0.05），并与组织分化及浸润深度密切相关（P<0.01）。在分化差（低分化、未分化、黏液腺癌、印戒细胞癌）的癌中，检出率高达76.5%（13/17），显著高于分化良好的（高分化、中分化）癌的23.1%，差异有非常显著性（P=0.005）;胃癌患者其肿瘤浸润深度达到深肌层及浆膜层，CK20mRNA阳性率高达66.7%（16/24），而6例浸润深度只达到黏膜层和黏膜下层的早期胃癌,均未检出CK20mRNA，差异有非常显著性（P=0.005）;在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中CK20mRNA阳性率高达68.2%（15/22），与Ⅰ、Ⅱ期的12.5%（1/8）相比，差异有显著性（P=0.012）；在伴有淋巴结转移的胃癌病例，其阳性率为65 .2%（15/23），亦明显高于不伴有淋巴结转移者14.3%（1/7），差异也有显著性（P=0.031）；浆膜浸润面积大于10cm2的患者门静脉血CK20mRNA检出率为64.7%（11/17）,与浆膜浸润面积0～10cm2的患者门静脉血CK20mRNA检出率38.5%（5/13）相比,无统计学意义（P=0.110）。见表1
表1 门静脉血CK20mRNA 检出率与胃癌病理特征之间的关系 略
3 讨论
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前对其局部原发肿瘤，采取以手术为主的治疗方法基本可以控制，但根治性手术治疗进展期胃癌的5年生存率为40%左右，早期胃癌为90%左右［5］，其中患者死亡的一个重要原因就是在肿瘤生长的早期即有癌细胞播散入血，如果能及早发现血液中转移的微量癌细胞，及时采取适当的治疗措施，杀灭这些转移的癌细胞，能够改善患者的预后。mRNA作为检测远处转移的标志物较蛋白质为好：其一，RNA在细胞外环境中极不稳定，极易分解和破坏；其二，血液循环中恶性肿瘤细胞破碎释放的RNA碎片，不影响检测结果。因此，检出mRNA，就意味着有表达此mRNA的有活力的完整的肿瘤细胞的存在。目前肿瘤细胞释放入血液的规律还不十分清楚，它的释放可能是间歇的［6］，若应用外周血检测血液中的微转移，就易导致样本误差，为了提高癌细胞的检出率，就要求我们在不同时间多次抽血或加大抽血量，这点常因患者拒绝而难以完成。血流丰富骨髓由于其特异性网状结构对癌细胞浓缩作用，部分国内外学者曾在患者骨髓中检测微转移灶［7，8］，但也常因患者不配合致其在临床应用中受到限制。据报道［9，10］门静脉血CK20mRNA检测有与骨髓相似的意义，其阳性率明显高于一次外周血液的同法检测。
本组研究表明其检出率为53.3% ；尤其在分化差（低分化、未分化、黏液腺癌、印戒细胞癌）的癌中，检出率高达76.5%。这些癌细胞通过血液循环种植到其他器官形成临床远处转移。癌细胞进入门静脉血液后，即成为术后远处转移和复发的种子，有研究证实除非在非常晚期，临床转移一般都是由微转移发展而来，而微转移只有少数发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4个步骤：第一，微量肿瘤细胞自原发处脱离；第二，肿瘤细胞适应新的代谢环境，逃避机体的免疫监测和杀灭；第三，肿瘤细胞侵袭远处组织；第四，在新组织中新血管生存，肿瘤生长。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主组织器官的微环境。动物实验表明，血液循环中至少有10000个肿瘤细胞才可以出现显性转移［11］，血液循环中的癌细胞受宿主的调控，大多被宿主免疫系统所清除而发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数按时增殖。患者血液循环中存在微转移，则提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能。需要说明的是，肿瘤的微转移病灶可长期处于细胞增殖周期中的G0期中或增殖与死亡处于平衡状态。当机体遭受种种打击时或当机体免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才能摆脱机体的抑制状态而持续增殖，肿瘤才发展为临床显性转移。由于围手术期患者免疫功能较平时低下，手术创伤又增加了循环癌细胞逃避免疫监视而易于形成微转移灶。转移病灶一旦形成，治疗将十分困难，预后亦很差。因此，检测胃癌患者门静脉血中的癌细胞，将血行转移的诊断和治疗提高到亚临床水平具有重要的临床意义。对本组患者跟踪随访，门静脉血CK20mRNA阳性的16例患者中有3例于术后6个月、术后7个月、术后9个月发现肝转移，而门静脉血CK20mRNA阴性的14例患者无1例出现转移灶。这亦说明了门静脉血液CK20mRNA阳性其预后不良。
对于胃癌患者而言，一旦门静脉血液中有CK20mRNA的表达，就意味着胃癌细胞已经播散入血液循环，门静脉血液内癌细胞阳性即意味着肿瘤已无法根治切除，此种患者应视为形成远处转移及术后复发的高危患者。对于这种患者，应加强术后监测，及早采取必要的措施。认为这种患者有采用全身化疗的明确指征。虽然门静脉血中癌细胞阳性的病例有远处转移的可能，但与已经发生临床远处转移有本质不同，改善该类患者预后的关键在于及时有效的杀灭血液循环中癌细胞，将微转移消灭在亚临床状态。对分化差（低分化、未分化、黏液腺癌、印戒细胞癌）的、有淋巴结转移的、Ⅲ+Ⅳ期的、浸润深度达到和（或）超过深肌层的胃癌患者，采取积极的手术方式可以在最大程度上减少肿瘤负荷，术后2周即开始全身化疗，也许是更好的方法。
【参考文献】
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11 Raj GV, Moreno JG, Gomella LG, et al. Utilization of polymerase chain reaction technoiogy in the detection of solid tumors. Cancer, 1998, 82: 1419-1442.
作者单位： 230000 安徽合肥，安徽医科大学第一附属医院
(编辑：毅 文)