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摘要:目的 探讨食品中李斯特菌（LM）检测的方法，以提高李斯特菌检出率。 方法 以国标法、Mini VIDAS和改良方法平行检测，结果经API鉴定;药敏试验用琼脂扩散法。 结果 在8类食品45件样品中，国标法检出7株可疑菌株，改良方法检出9株可疑菌株，经国标生化法鉴定其中均有1株为默氏李斯特菌，其他均为LM，而检出的所有菌株经API鉴定均为LM。Mini VIDAS法均未检出LM。药敏试验显示LM对万古霉素、红霉素、麦迪霉素、先锋Ⅴ、SMZ、庆大霉素、氨苄青霉素等全部敏感;而对萘啶酸、头孢氨塞肟、头孢克肟、奥普托欣、多粘菌素B等则全部耐药。 结论 改良方法对LM检出高于国标法，Mini VIDAS检测LM需进一步摸索，API法鉴定LM方便快捷。
关键词:李斯特菌;API鉴定;Mini VIDAS;药敏试验
The detection of Listeria in food and results of drug sensitivity test.
CHEN Hui-yan，HONG Cheng-ji，LI Yi，et al.
（Wenzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention，Wenzhou325000，Zhejiang，P.R.China）
Abstract:Objective To enhance the rate in detection of Listeria and explore various detection methods. Methods Interna-tional standard method，mini-VIDAS and modified methods were used for parallel detection and the results were differentiated and compared by API.A agar diffuse method was used for test of resistance of bacteria to antibiotics. Results Seven suspected Listeria strains out of the45samples in8kinds of foods，were detected by international standard method;9by modified method.One of these strains isolated was identified as Listeria.murray by biochemistry of national standard methods，however，others were LM.All strains detected were identified as LM by API，not detected by Mini VIDS.Listeria was highly sensitive to vancomycin，ery-thromycin，midecamycin、cefazolin sodium、SMZ、gentamycin and ampicillin（100%）.However，all strains were high resistances to nalidixic acid，cefotaxime sodium，cefixime、optochin and polymyxin B（100%）. Conclusion The rate in detection of Listeria by modified method is higher than that of international standard method.MiniVIDS needs to be further explored.API method is simple and rapid.
Key words:Listeria;API differentiation;Mini VIDAS;Resistance test
单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM）是一种人畜共患致病菌，食品中存在的LM对人类引起人类多种疾病，死亡率高达35%～70% ［1］ 。该菌在自然界中分布广泛，近年来，作为通过食物传播的重要致病菌引起许多国家食品卫生界人士的广泛关注，将其列为21世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一，并建立了LM食源性疾病报告系统。由此可见，患病动物及食品中LM的潜在危险性很大。因此，研究一套高效可行的检测方法显得十分必要。本文采用Mini VIDAS法、和国标法 ［2］ 和改良方法平行，对45份样本进行检测比较，评估其优缺点。
1 材料与方法
1.1 标准菌株 单增李斯特菌（LM）（CMCC54002）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）和马红球菌均由浙江省CDC提供。
1.2 主要培养基 增菌培养液（LB 1 、LB 2 ）、TSI、SIM等由上海市CDC提供，李斯特显色培养基，MH琼脂、MMA琼脂等由浙江省CDC提供，API LISTERIA生化试剂条、Half Fraser肉汤、Fraser肉汤、VIDAS LIS试剂条等为法国生物梅里埃公司提供。
1.3 主要仪器 Mini VIDAS仪、ATB细菌生化鉴定仪为法国梅利埃公司产品。
1.4 样品来源 采集温州市区各农贸市场及超市的家禽类、熟制品、水产品、果汁、猪肉、羊肉、牛肉等。
1.5 方法
1.5.1 国标方法 按国标GB/T4789-30-2003 ［2］ 方法进行李氏增菌培养液（LB 1 、LB 2 ）两次增菌后，将LB 2 培养物转种到MMA30℃24h培养，用白织灯45°角斜光照射平板，挑取灰蓝或蓝色小菌落做镜检、动力、生化、cAMP试验、溶血试验。
1.5.2 VIDAS法 包括VIDAS LIS ［3］ 和LB 1 、LB 2 增菌法。VI-DAS LIS第一次增菌取25g（ml）样品加225ml Half-Fraser肉汤中，30℃24h培养，第二次增菌取第一次增菌培养液0.1ml加入10mlFraser肉汤中，30℃24h培养;LB 1 、LB 2 增菌法同国际作李氏增菌培养液（LB 1 、LB 2 ）两次增菌培养。取上述两种方法的第二次增菌培养液1ml于无菌试管中，煮沸10min，冷却后进行检测LM。按VIDAS机作业指导书，取500μl加入到VIDAS LIS试剂条样孔内检测，45min后报告结果。阴性报告未检出，阳性做确证试验。同时用阳性菌株进行对照。
1.5.3 良改方法 ①冷增菌法:按国标法作李氏增菌培养液（LB 1 、LB 2 ）两次增菌后，置冰箱（冷藏室）过夜，再接种到科码嘉李斯特菌选择性显色培养基30℃24h/48h培养，挑取蓝色带晕菌落接种TSI、SIM半固体25℃24～72h观察结果:TSI+/+、H 2 S-、SIM半固体形成倒伞状生长，染色镜检为G + 短小杆菌者接种到血平板35℃24h纯培养，取培养物接种API LISTERIA生化试剂条35℃24h观察结果。同时用LM菌标准菌株进行对照。②李氏增菌培养液LB 1 （或LB 2 ）:取25g（ml）样品加225ml LB 1 （或LB 2 ）增菌液，30℃24h，取0.1ml加入10ml LB 2 （或LB 1 ）增菌液30℃24h培养，接下操作同①。
1.5.4 药敏试验 采用琼脂扩散（K-B）法，使用浙江省微生物试剂有限公司生产的药敏纸片及判断标准，药敏纸片均在有效期内使用。将分离的12株LM（3株另起调查中检出）对21种抗菌药物作药敏试验。
2 结果
2.1 LM阳性率 从45份样品中检出LM9株，染菌率为20%。详见表1。
2.2 改良方法与国标法检测结果比较 ①冷增菌法:将LB 2 增菌液培养后，置冰箱（冷藏室）过夜，再接种到科码嘉李斯特菌选择性培养基35℃24h/48h培养，分离结果明显好于直接分离。②李氏增菌培养液LB 1 （或LB 2 ）:李氏增加菌培养液无需LB 1 、LB 2 之分，两者之间没有差异。详见表1。
表1 改良方法与国际法检测LM效果的比较（略）
2.3 API法鉴定特异（可靠）性的考察
2.3.1 分离LM菌株的生物学性状 所分离试验菌株为G + 短小杆菌，在李斯特显色培养基上为浅蓝色的带晕轮样菌落，SIM半固体中25℃培养后形成倒伞状生长，36℃培养后没有形成伞状生长，TSI的反应为+/+，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性。
2.3.2 API法与国标生化法的鉴定结果比较 9株待检菌株按API李斯特菌生化测试条酶底物、七叶灵水解、α-甘露糖苷酶、D-阿拉伯糖醇产气、D-木糖产气、鼠李糖产气、α-甲基-D-葡萄糖苷产气、核糖产气、葡萄糖-1-磷酸盐产气、塔格糖产气的结果均为LM，数码图谱为6510及6550。9株待检菌株按国家标准方法GB/T4789.30-2003进行鉴定结果8株为LM，1株为默氏李斯特菌。两法鉴定标准株均正确即符合。
2.4 VIDAS法检测结果
2.4.1 Fraser肉汤与LB增菌液增菌检测结果一致 45件样品采用两套增曲液增曲后用VIDAS仪均未检出LM，标准菌株及对照均检出LM阳性。
2.4.2 VIDAS法待检液加热与未加热的结果比较 将经APl确认为LM的菌株接种血平板35℃24h培养后转种Fraser肉汤30℃24h培养，取培养液及其经加热煮沸10min处理的两检测的阴、阳性结果一致，仅测定数值略有差异。
2.4.3 VIDAS法检测阳性率的考察 取经APl确认含有LM的8份检样经李氏增卤液两次增菌后，上机检测结果仅2份检出阳性，检出阳性率为25.00%;另将经APl确认为LM的8个菌株分别接种血平板培养后各挑取5个菌落接种10ml LB 2 增曲液30℃24h培养，取其上机检测，结果8份检样5份阳性，检出率为62.50%。
2.5 cAMP试验 检出的9株LMcAMP试验全部阴性。
2.6 溶血试验 取各被检菌株接种营养肉汤36℃24h培养物1ml加入1%绵羊RBC混匀后放入36℃2h观察初步结果，再放4℃冰箱过夜观察最后结果。分离的9株LM和LM标准菌株及金黄色葡萄球菌均早溶血现象，马红球菌不溶血。将各被检培养物加热56℃30min后再作溶血试验结果均不溶血。挑取纯培养物穿刺接种厚的血平板36℃48h培养可见微弱的溶血环。
2.7 药敏试验结果 将分离到的12株（3株另为调查中检出）LM对21种抗菌药物进行敏感试验。结果见表2。
表2 检出的12株LM药敏结果（略）
3 讨论
3.1 关于国标法针对李斯特曲的检测手段列入国标只有常规增菌法，但实践觉得这方法在实际应用中并不理想，培养时间长，操作繁琐，MMA平板菌落特征不明显，难以辨认。本文选用科码嘉李斯特曲选扦性显色培养基进行分离，李斯特菌在该培养基上生长的菌落形态为浅蓝色的带晕轮，很有特征，极易辨认。
3.2 VIDAS法 对LM检出率不理想。对国标法检出7份阳性、改良法检出9份阳性的45件样品均未检出阳性，与温瑞荣报道 ［4］ 结果阳性率达18.94%相差甚远，有待进一步探讨。加热与未加热只是在测定的数值略有差异，结果阴、阳性一致。故用VIDAS法检测LM没有必要加热。经APl确认含有LM的8件样品，用VIDAS法检测LM阳性2件，检出率仅为25.0%，漏检75%:8株LM菌株纯培养物用VIDAS法检测，LM阳性5株，检出率为62.5%，漏检37.5%。
3.3 培养基 增菌液LB 1 与LB 2 区别并不大，本次对照测试中没有显著差异。显色培养基的增补剂必须在磁力搅拌机搅拌30min，加入到基础培养基中的温度不能过高，否则增补剂被破坏，显色培养基保存时间过长，培养后菌落周围的晕不明显，易造成假阴性。
3.4 改良法的效果 国标法LB 1 先增菌24h后，LB 2 再增菌24h，然后划平板培养24h（按培养基说明书要求）挑选可疑菌落，本文按国标法增菌后置4℃冰箱过夜然后转种科玛嘉显色平板，检出率高于国标法，且杂菌更少，菌落更易辨认，另划平板培养48h挑选可疑菌落更好些。
3.5 生化试验 国标法需做溶血、硝酸盐还原、尿素酶、MR/VP、甘露醇、鼠李糖、木糖、七叶苷及cAMP等试验，操作繁琐、工作量大新手不易掌握等。用法国梅里埃的API试剂条，对分离的9株疑似菌株鉴定均为LM菌，APl法为国际公认的金标方法，验证只需1d，无需特殊设备，易操作掌握。
3.6 溶血试验 cAMP试验据文献报道，LM分溶血和非溶血两种，本文9株LM菌cAMP试验阴性8株、阳性1株，这与资料报道的 ［5］ 相符。但cAMP试验操作技术要求高、马红球菌标准菌株难以保存、试验结果不易观察;另溶血试验本文采用试管法操作简单观察容易，9株检出的LM菌溶血试验全部阳性，并均为不耐热溶血素。
3.7 药敏试验 药敏结果12株LM对头孢菌素类除先锋V100%敏感外，其余几种均100%耐约。已有资料表明 ［6］ ，此菌耐药性可以转移，牛奶和奶制品的肠球菌可作为李斯特菌的耐药基因的来源，LM耐药性的发展对治疗这种病死率极高的感染将是严重的挑战，应加以密切关注。
针对李斯特菌的检测手段，目前国内有常规增菌法、PCR法等等，这些方法在实际应用中都不十分理想，从主观上分析，这些方法检出率明显低于国外报道的检出率，原因之一也可能是客观上我国食品受LM菌污染没有国外严重，原因之二就是国内现行的各种检测手段不理想造成的，另可能是基层工作者对检测该菌的经验不足，漏检等因素降低了检出率。
（本文承蒙温州市疾病预防控制中心副主任技师周哲本指导帮助，谨此致谢）
参考文献:
［1］Sehlech W.F，et aL.Epidemic Listeriosis-evidence for Trarismission by Food N［J］.J.Med，1983，308:203～206.
［2］卫生部，中国国家标准化管委会发布.中华人民共和国国家标准，食品卫生检验方法.微生物分册［S］.GB/T4789.30-2003.北京:中国标准出版社，2004.
［3］上海祥和科学技术有限公司编.生物梅里埃李斯特菌属操作流程.
［4］温瑞荣，符振华，符鹏，等.VIDAS自动免疫分析系统快速检测食品中李斯特菌［J］.中国卫生检验杂志，1999，9（1）:49～50.
［5］胡桂华，安静，栾颖，等.沈阳地区食源性李斯特菌带染研究［J］.职业与健康，2003，19（2）:61～62.
［6］Henrik C WHO.沙门菌及食源性致病菌耐药性监测培训班［Z］.2001，4.