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摘要:目的 构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒，利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。 方法 应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+），运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1（+）/LipL21转染入HeLa细胞，免疫组化法观察目的基因的表达。 结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3.1（+）/LipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3.1（+）/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。 结论 成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3.1（+）/Lipl21，且能够在体外真核细胞中表达，为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。
关键词:钩端螺旋体;外膜脂蛋白;DNA疫苗;真核表达
Construction of eukaryotic recombinant plasmid caontaining the Lip121gene of leptospira and its expression in HeLa cells.
HE Han-jiang，WANG Wen-yu，LI Li-hua，et al.
（Medical School of Xiangnan College，Chenzhou423000，Hunan，P.R.China）
Abstract:Objective To construct the eukaryoctic expression recombinant plasmid containing the outer membrane Lipoprotein Lipl21of the Leptospira interrogans serovar Lai，and transfect it into HeLa cells to express target protein Lipl21，to provide a new can-didate antigen for preventing leptospirosis. Methods Lipl21Gene was amplified from the genomic DNA of Leptospira interrogans serovar Lai，strain Lai56601by polymerase chain reaction（PCR），and the gene was inserted into cloning vector pUCm-T.The in-serted Lipl21gene was subcloned into appropriate site of pcDNA3.1（+）vector.The positive clones were acquired after being identi-fid with restrictive enzymes and sequence analysis.After being sequenced with DNA auto-sequence analysis instrument，The ampli-fied DNA sequence of Lipl21was searched for alignment with NCBI Blast program，and the recombinant plasmid was transfected into HeLa cells using Liposome. Results The target gene Lipl21segment about561bp was obtained successfully.cells Immunocyto-chemistry analysis showed that the recombinant plasmid can be expressed in HeLa cells. Conclusion The recombinant plasmid of pcDNA3.1（+）/Lipl21was constructed successfully，and can be expressed in HeLa cells，which provided the experimental basis for developing novel nucleic acid vaccine preventing leptospirosis.
Key words:Leptospira;outer membrane Lipoprotein;DNA vaccine;Eukaryotic expression
钩端螺旋体病（Leptospirosis，简称钩体病），是由致病性钩端螺旋体（Leptospira interrogans，简称钩体）引起的一种人兽共患病，呈世界性分布，在我国流行比较严重，31个省份报告有病人或带菌动物。该病为我国法定的乙类传染病，严重危害我国人们的身体健康和畜牧业生产。目前国内外所用的钩体疫苗免疫保护作用有限，因此，发展新型钩体疫苗甚有必要。钩体外膜蛋白一直被认为具有良好的抗原性，其Lipl21是Haake ［1，2］ 等研究发现的一个分子量约为21KD的外膜表面暴露性脂蛋白，存在于致病菌株而不存在于非致病菌株，具有很高的免疫原性，在菌株感染期间表达，且在不同菌株间具有较高的同源性，可望成为预防钩体感染的候选疫苗分子。本实验以Lipl21为目的基因片段，构建其真核重组体pcDNA3.1（+）/Lipl21，利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，以期为进一步确定Lipl21为新的候选疫苗分子奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料 钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株，购自湖南省疾病预防控制中心，真核表达质粒pcDNA3.1（+）及所用宿主菌JM109和Hela细胞株为本研究室保存;PCR扩增相关试剂、T4连接酶、pUCm-T vector购自上海生工生物工程技术服务有限公司;EcoRI和XhoI内切酶、DNAMarker DL15，000、质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;200bp DNA Marker，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自华美生物工程公司;兔抗钩体血清通过用灭活的钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株免疫健康家兔获得。其它化学试剂均为国产化学纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 钩端螺旋体赖型56601株基因组DNA的提取 钩端螺旋体赖型56601株采用含8%兔血清的Korthof培养基在28～30℃培养7～10d，收集菌体，于56℃灭活1h。常规方法提取基因组DNA，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA的大小，以此基因组作为扩增Lipl21目的基因片段的模板。
1.2.2 PCR扩增钩端螺旋体Lipl21基因 根据GenBank基因序列AY187271设计引物，并引入EcoRI和XhoI酶切序列，上游引物P1:5'_CG GAA TTC ATG ATC AAT AGA CTT ATA GCT C_3';下游引物P2:5'_CC GAG CTC TTA TTG TTT GGA AAC CTC TTG A_3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成，依次将模板2μl、25pmmol引物、2.5mmol/LdNTPs、10×PCR Buffer5μl、Mg 2+ 1.5mmol/L及Taq DNA Polymrase0.5μl加入反应管内，加水至总反应体系为50μl，以如下条件进行PCR反应:95℃预变性5min，95℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸1min30sec，35个循环，72℃终止延伸10min。反应结束后进行1.5%的琼脂凝胶电泳鉴定结果，通过DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。
1.2.3 真核表达重组体pcDNA3.1（+）/Lipl21的构建与鉴定 将回收纯化的PCR产物和质粒pUCm-T以3:1的比例在T4连接酶作用下16℃连接过夜，转化至宿主菌JM109，经蓝白斑筛选、PCR鉴定，EcoRI和XhoI双酶切确认后用DNA胶回收试剂盒回收克隆载体上切下的Lipl21目的基因片段，同样以EcoRI和XhoI双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+），将Lipl21目的基因片段定向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上，构建重组质粒pcDNA3.1（+）/Lipl21，经PCR、双酶切鉴定后，挑阳性克隆送大连宝生物工程有限公司测序鉴定。
1.2.4 重组表达质粒的瞬时表达鉴定 通过脂质体介导法瞬时转染HeLa细胞，转染操作按Invitrogen公司提供的脂质体Lipofectamine T 2000操作说明书进行，同时以转染空质粒pcD-NA3.1（+）的HeLa细胞做阴性对照。转染48h后，弃去细胞培养液，预冷PBS洗涤3次，95%的乙醇室温固定60min;预冷PBS洗涤3次，加入过氧化酶阻断剂（1:5030%H 2 O 2 :甲醇）阻断细胞内源性过氧化酶反应30min;PBS洗涤3次后用封闭液封闭20min;加一抗（1:100稀释的兔抗钩体血清）4℃孵育过夜;充分孵育后预冷PBS洗涤3次，加入二抗（1:1000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG）室温孵育1h，滴加DAB显色后苏木素复染1min;梯度酒精和二甲苯脱水，在倒置荧光显微镜观察并拍摄结果。
2 结果
2.1 钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段PCR扩增结果 以上述提取的56601株基因组DNA为模板，用自行设计的特异性引物PCR扩增，成功获得了目的基因片段Lipl21，片段大小与目的片段相符（见图1）。
图1 Lipl21的PCR结果（略）
1-2:PCR产物;3:阴性对照;4:200bpDNA marker
2.2 重组质粒pcDNA3.1（+）/Lipl21的PCR、酶切鉴定 将重组质粒pcDNA3.1（+）/Lipl21做PCR和用EcoRI和XhoI双酶切鉴定，鉴定结果见图2。
图2 重组质粒pcDNA3.1（+）/Lipl21的PCR和双酶切鉴定结果（略）
1.DNAMarker DL15，000;2.空质粒双酶切;3.重组质粒双酶切;4.空质粒的PCR;5.重组质粒PCR;6.200bp DNAMarker
2.3 真核表达重组体pcDNA3.1（+）/Lipl21的测序鉴定与同源性比较 将含有pcDNA3.1（+）/Lipl21重组质粒的JM109菌液送大连宝生物工程有限公司进行DNA序列测定，结果显示重组质粒含有561BP的目的基因片断，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。并将测序结果及其推导所编码的氨基酸序列在NCBI数据库进行核苷酸水平和氨基酸水平的同源性比较，结果显示，Lipl21的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列在已报道的6种不同的致病性钩体菌株间的同源性达96%～100%。
2.4 Lipl21基因在HeLa细胞中的瞬时表达鉴定 将pcD-NA3.1（+）/Lipl21真核表达重组体转染HeLa细胞48h后，细胞免疫组化结果显示在部分细胞胞浆内可见棕黄色的阳性产物，而空质粒pcDNA3.1（+）转染的HeLa细胞胞浆内未见棕黄色的阳性产物，见图3。
图3 HeLa细胞转染后免疫组化结果（200×）（略）
A.pcDNA3.1（+）/Lipl21转染HeLa细胞结果;B.pcDNA3.1（+）转染HeLa细胞结果
3 讨论
我国是世界钩体病主要流行地区之一，且我国钩体的血清型别多，目前发现有18个血清群75个血清型 ［3］ ，是发现血清型最多的国家。在长江流域及以南地区，主要流行黄疸出血群、爪哇群、波摩那群等，在长江流域以北菌群较少，主要是波摩那群 ［4］ 。其中黄疸出血群赖型是我国的特有菌型，其致病力强，流行区域广，病死率高，患者常常骤发肺弥漫性大出血而死亡 ［5］ 。目前钩体病发病率虽已呈下降趋势，但病死率仍达2%～4%，严重危害人类健康和畜牧业生产。钩体疫苗是预防钩体病的主要手段，目前已经出现的钩体疫苗主要有3类，即灭活全钩体疫苗、钩体组分疫苗（主要是外膜疫苗）、基因工程疫苗。最常应用的是钩体灭活疫苗，外膜疫苗在我国少量试用，取得了一定的预防效果，但二者皆不能有效地预防多种不同血清型钩体的感染、免疫持续时间短、制备疫苗需要大量培养钩体（增大了操作人员感染钩体的机会）、生产周期长等缺点 ［6，7］ 。目前，DNA疫苗在多种感染性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病的预防和治疗方面的研究方兴未艾。与传统的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗以及重组疫苗相比，DNA疫苗具有易于制备、免疫效果好且持久，无毒力回复等特点成为近年来的研究热点。目前钩体候选疫苗分子的研究主要集中在Li-pL32、LipL41及OmpL1，以腺病毒为载体表达的LipL32（Hap1）及LipL32DNA疫苗在沙鼠中可抵抗同型钩体的感染，并具有良好的交叉保护作用 ［8］ 。真核载体表达的LipL32/1-OmpL1/1融合蛋白也表现出了良好的免疫原性 ［9］ ，Lipl21是存在于所有致病菌株的外膜表面暴露性脂蛋白，具有很高的免疫原性，Haake ［2］ 等用Lipl21原核表达的纯化产物免疫新西兰兔，产生了滴度达1/50～1/32，000的抗体，且其在不同菌株间具有较高 的同源性（达96%～100%）。同时以大肠杆菌表达的LipL21作为检测抗原，发现感染钩体的动物及病人血清中均存在抗Li-pL21抗体，由此我们推测Lipl21可望成为预防各型钩体感染的候选疫苗分子。本实验以Lipl21为目的基因片段，成功构建了其真核重组体pcDNA3.1（+）/Lipl21，利用脂质体体外转染HeLa细胞，首次证实其在体外真核细胞中能有效表达，为进一步确定Lipl21为新的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。下一步将探讨真核表达重组体的免疫原性及其对豚鼠的免疫保护性研究。
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