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Fusion protein of26-peptide-melittin and interleukin-2influenced the growth of HeLa cell in vitro
Ding Shouyi，Qian Dongmeng
Department of Microbiology，Qingdao Medical College，Qingdao266021.
【Abstract】 Objective To investigate the influence of fusion protein of26-peptide-melittin and interleukin-2on the growth of human cervical cancer cell in vitro.Methods The anti-tumor activity of the fusion protein of melittin and interleukin-2was detected by MTT method，and its influence on the morphology of HeLa cell was ob-served too.Results The fusion protein had inhibitory effect on HeLa cell，and the inhibitory rate was relevant to its concentration.After incubation for24～48h，the cells showed evident morphologic changes in optic microscope.Con-clusion The fusion protein of melittin and interleukin-2could inhibit the proliferation of HeLa cell.
【Key words】 fusion protein of26-peptide-melittin and interleukin-2 HeLa cell MTT
蜂毒溶血肽（melittin）是蜂毒的主要组分，具有免疫调节作用，通过增强Th 1 淋巴细胞功能，降低Th 2 淋巴细胞功能，达到抗过敏、抗炎症、抗肿瘤等治疗效果 ［1］ ，体外试验，蜂毒肽对淋巴瘤、肉瘤有细胞毒作用，对Rous肉瘤和HeLa细胞（宫颈癌细胞）均有抑制作用，其作用机制是蜂毒素使细胞微粒体膜溶解，抑制其呼吸，从而抑制肿瘤组织生长 ［2］ 。但大剂量蜂毒素毒性较明显。白细胞介素-2（IL-2）是由体内活化的T细胞分泌的，具有多种与免疫功能强化有关的生物学活性 ［3，4］ 。其制剂已用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病并取得了显著的效果。但IL-2制剂在临床使用过程中，显示出抗肿瘤的活性不够特异，另外也伴随着对正常细胞的毒性。蜂毒素、IL-2单独使用时产生的副作用限制了它们在临床的广泛应用。因此增加疗效、减少副作用是人们所期待的，为了达到减毒增效之目的，本实验室利用基因工程技术获得了重组嵌合蛋白，在此基础上本文研究了26肽蜂毒素-IL-2嵌合蛋白对体外培养的HeLa细胞生长的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂 RPMI-1640干粉培养基，美国GIBCO公司产品;胰酶，AMERSCO公司产品;新生牛血清，杭州四季青产品;四甲基偶氮唑蓝（MTT），Sigma公司产品;96孔培养板，Coster公司产品;嵌合蛋白，本室构建。
1.2 细胞株 HeLa细胞株购自山东省医学科学院药物研究所，RPMI-1640基础培养液中加入10%新生牛血清，1×10 5 U/L青霉素，100g/L链霉素，置37℃5%CO 2 孵箱中培养，3～4天传代1次。人成纤维细胞本室保存，传代培养同HeLa细胞。
1.3 仪器和设备 酶联免疫检测仪系BIO-RAD公司产品，CO 2 孵箱系美国SHELLAB公司产品，倒置显微镜系公司产品（OLYMPUS），电子分析天平（Sartorius），低温高速离心机系德国Heracus公司产品。
1.4 细胞增殖试验 取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化后10%的小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成5×10 5 /L细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200μl，置37℃，5%CO 2 孵箱中培养12～24h后分别加入2.5，5.0，10，20，40mg/L不同稀释度的嵌合蛋白，并以阿霉素（20mg/L）作阳性对照，生理盐水作阴性对照。同时以正常人二倍体成纤维细胞作细胞对照。每个浓度设6个复孔，置37℃，5%CO 2 孵箱中继续培养72h，培养结束前4h，每孔加入MTT20μl，37℃培养箱中培养4h，离心弃上清后每孔加二甲基亚砜200μl，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色（波长570nm），测吸光度并计算嵌合蛋白对HeLa细胞的抑制率，求IC 50 。HeLa细胞抑制率=1-（实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
1.5 光镜形态学观察 细胞接种在放有盖玻片的6孔培养板中培养，待细胞生长至对数生长期，加入不同稀释度的嵌合蛋白，继续培养，定时镜下观察。
1.6 统计学方法 每份样本平行测定6孔，数据均以ˉx±s表示。
2 结果
2.1 嵌合蛋白对HeLa细胞生长的抑制作用 作用3天后高浓度组较低浓度组对细胞的抑制作用增强，细胞抑制率见表1，各浓度组嵌合蛋白对人二倍体成纤维细胞均无明显影响。
表1 嵌合蛋白对HeLa细胞增殖抑制率的影响 浓度（略）
2.2 倒置显微镜观察 阴性对照组HeLa细胞生长良好，细胞伸展，呈不规则多角形。实验组培养24h后HeLa细胞数目减少，随着时间的推移，细胞明显皱缩，浆内出现空泡，胞内颗粒增多，培养液中有许多漂浮的呈桑叶状细胞，72h后上述改变更为明显。
3 讨论
本实验选用通用癌细胞株HeLa细胞，并以正常人二倍体成纤维细胞作对照，应用MTT法研究了嵌合蛋白对HeLa细胞生长的影响。实验结果表明，嵌合蛋白对HeLa细胞的生长有抑制作用，10mg/L的嵌合蛋白对HeLa细胞有明显的抑制作用，且随浓度及时间的增加抑制作用增强。同样条件下嵌合蛋白对正常人二倍体成纤维细胞的影响不明显。光镜观察结果显示嵌合蛋白作用24h后细胞出现形态学改变且随时间的增加更为明显。分子生物学研究表明，蜂毒肽具有膜活性特点，与膜作用时，随着时间的变化，四聚体衰变为稳定的三聚体和单体。这个持续的构型变化将伴随着含水孔的横向扩张，主要由α-螺旋之间的静电排斥造成孔增加，因此细胞裂解 ［5］ 。蜂毒肽具有对肿瘤细胞的选择性杀灭作用，又具有相对分子量小、热稳定性、无免疫原性等特点。IL-2是TC的淋巴因子，它能够增强LAK及NK细胞肿瘤杀伤活性 ［6，7］ ，具有高效的抗肿瘤作用。嵌合蛋白没有破坏IL-2的重要决定簇，同时降低了蜂毒肽的毒性，嵌合蛋白能协同IL-2与蜂毒肽增强细胞免疫的作用，能特异并高效激活CTL对肿瘤细胞的杀伤。它基本保留了抗肿瘤效应，同时减轻了蜂毒素、IL-2对正常细胞的毒性，这种独特的双重作用有利于肿瘤病人的综合治疗和康复。嵌合蛋白作为一种高效、低毒的抗肿瘤药物，其确切的作用机制有待于进一步深入研究。
参考文献
1 Marek J，Werner J P，Dejan S，et al.Bee venom immunotherapy re-sults in decrease of IL24and increase of IFN2γseccretion in specific allergen stimulated T cell cultures.J Immunology，1995，4178:154.
2 Lowy PH，M Itchell HK，T Racy UW.Bee venom phospholipase A2;effects on drosophila larval，HeLa cells and membranes.Toxicin，1976，14（3）:2032212.
3 Henney CS，GallOK.Interleukin-2augments natural killer cell activi-ty.Nature，1981，291:335-338.
4 Gillis S，Smith KA.Long term culture of tumor-specific cytotoxic T cells.Nature，1977，268:154-156.
5 Yang S，Carrasquer G.中国药理学报，1997，18（1）:3-5.
6 Aronson FR，Libvby P，Brandon EP，et al.IL-2rapidly induces natural killer cells adhesion to human endothelial cells.J Immunol，1998，141:158-163.
7 Asano Y，Tada T.Generation of T cell repetition two distinct mecha-nisms for generation of T supressor cell T helper cells and T segmenting cells.J Immunol，1998，142:365:373.
基金项目:山东省自然科学基金资助（E99CO2）;教育部高等院校骨
干教师专项资金重点资助课题;青岛大学科研基金项目
作者单位:266021青岛大学医学院微生物教研室