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【摘要】 目的 探讨电化学治疗对宫颈癌Hela细胞中电压激活性K+电流和K+通道KCNJ16基因表达以及细胞增殖的影响。方法 运用全细胞膜片钳技术，记录和分析电化学治疗对宫颈癌Hela细胞中电压激活性K+电流的抑制作用;运用RT-PCR技术，检测电化学治疗对宫颈癌Hela细胞KCNJ16基因表达影响;通过细胞体外增殖试验，证实电化学治疗对Hela细胞增殖的抑制作用与K+电流及KCNJ16基因表达的关系。结果 在（5V，10C）的电化学治疗剂量下，可将阴极处细胞峰值外向K+电流(除极化到+50 mV时激活)从（1.22±0.11）nA降低到（0.96±0.10）nA，可将阳极处细胞峰值外向K+电流降低到（1.02±0.10）nA。K+通道KCNJ16基因在10例Hela细胞CDNA模板中表达率为100%，在10例电化学治疗后阴极细胞CDNA模板中表达率为70%，在10例电化学治疗后阳极细胞CDNA模板中表达率为90%。经电化学治疗后，阴阳两极的细胞K+通道KCNJ16基因表达均有下调。细胞计数生长曲线结果显示：利用含K+通道开放剂比那地尔的细胞培养液培养经电化学治疗后的细胞，可使细胞生长曲线比用普通培养液培养经电化学治疗后的细胞上调，提示K+通道开放剂能部分阻断电化学的治疗作用。结论 电压激活性K+通道在Hela细胞增殖过程中起重要作用，电化学治疗能使K+通道基因表达和电流受抑制，K+通道开放剂能部分抵消电化学治疗对Hela细胞的作用，因此阻断K+通道为电化学治疗对Hela细胞的作用机制之一。
【关键词】 宫颈癌Hela细胞；电化学治疗；全细胞膜片钳记录；钾离子通道；细胞增殖
Influence of electrochemotherapy on voltage-activated K+ current and cell proliferation in cervical cancer Hela cells
LIU Chan-zhen,TANG Bu-jian,LI li,et al.Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021,China
［Abstract］ Objective To study the inhibition of voltage-activated K+ conductance and cell proliferation by electrochemotherapy in the human cervical cancer Hela cells.Methods Inhibition of voltage-activated K+ current by electrochemotherapy through the whole-cell patch-clamp technique was studied.To observe the expression of gene KCNJ16 influenced by electrochemotherapy through the RT-PCR technique.To observe growth tendency of Hela cell treated by electrochemotherapy through counting live cells and drawing growth curve.Results The whole-cell patch-clamp test showed that around the negative electrode，the Hela cells treated by electrochemotherapy reduced the peak outward K+ current (evoked by a depolarization to +50 mV) from (1.22±0.11) nA(n=10) to (0.96±0.10) nA(n=10).And around the positive electrode，the Hela cells treated by electrochemotherapy reduced the peak outward K+ current (evoked by a depolarization to +50 mV )from (1.22±0.11) to (1.02±0.10) nA(n=10).From the RT-PCR test，we could find that both in negative electrode and in positive electrode，the expression of the gene KCNJ16 of Hela cells after treatment by electrochemotherapy is lower than that of normal Hela cells.And through counting live cells and drawing growth curve，the results showed that after electrochemotherapy，the proliferation of Hela cells was inhibited both in negative electrode and in positive electrode，but the effect of inhibition could be recovered in the case of the existence of Pin，which activates the K+ channels in the cell membrane.Conclusion The voltage-activated K+ channels expressed by Hela cells play an important role in Hela cell proliferation.The electrochemotherapy inhibits the proliferation of the Hela cells by inhibited K+ channel in the cell membrane.
［Key words］ cervical cancer Hela cells;electrochemotherapy，the whole-cell patch-clamp recording;potassium channel;cell proliferation
电化学疗法(electro-chemotherapy，ECT)是近20年发展起来的治疗恶性肿瘤的新技术，是通过施加直流电场于肿瘤组织，使阴极和阳极的组织细胞分别产生不同的pH变化、水电解质的变化、自由基的变化等，从而影响肿瘤组织细胞的生长周期、局部及全身免疫反应等，抑制肿瘤的生长［1］。大量的研究表明，电化学疗法是一种操作简便、疗效好、安全性较佳的肿瘤局部治疗方法。对人体深部和浅表的肿瘤破坏性强，且破坏肿瘤的范围能受到有效控制，在肿瘤的局部治疗中展现出广阔的应用前景，目前已广泛应用于宫颈癌的局部治疗，成为宫颈癌重要的辅助治疗措施。
已有研究确定经电化学治疗一定的电量后，阳电极区及阴电极区组织中的离子浓度发生相当大的变化，对人体有显著生理作用的电解质K+、Na+、Cl-、Mg2+均向阴极区组织迁移，而Ca2+、Cu2+则向阳极区组织移动［2］。但是电化学治疗后离子通道的变化与其对肿瘤的治疗机制的关系仍然不明。最近10余年的众多研究表明，细胞膜上K+通道的活性对细胞增殖起关键作用，本文主要研究电化学治疗对宫颈癌Hela细胞中电压激活性K+电流的影响，以及对钾通道基因表达的影响，从而分析电化学的治疗作用机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和溶液 RPMI-1640干粉，美国GIBCO公司产品；HEPES、胰蛋白酶、TTX、TEA-CL、Na2ATP均为Sigma公司产品；小牛血清（FBS）为杭州四季青公司产品。其余试剂均为国产分析纯。膜片钳实验所需细胞浴液成分:NaCl 135 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、CaCl2 1.8 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、TTX 4×10-4 mmol/L、Glucose 10 mmol/L、NaH2PO4 33 mmol/L。电极液成分:KCl 140 mmol/L、CaCl2 1 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、EGTA 11 mmol/L、Na2ATP 2 mmol/L、HEPES 10 mmol/L。以上两种溶液均用NaOH调pH值到7.2，使用前用0.2 μmol/L的滤膜滤过。TEA-CL被蒸馏水溶解，配制成20 mmol/L，4 ℃下备用［3］。
1.2 细胞培养 本实验所用的Hela细胞来至中国科学院上海生物细胞研究所细胞库，于37 ℃、5% CO2且湿度恒定的孵育箱中培养。培养基为RPMI-1640，含10%小牛血清。每次全细胞膜片钳实验前，将细胞置于涂有多聚赖氨酸的玻璃平皿中贴壁，24 h后可进行操作。
1.3 全细胞膜片钳记录和分析 全细胞膜片钳记录在室温下进行(22 ℃～25 ℃)。刺激频率为0.5 Hz，钳制时间为200 ms，保持电压从-80 mV逐步去极化到+50 mV，每级10 mV，诱发出外向K+电流［3］。同一细胞完成上述实验后，分别加入20 mmol/L的TEA-CL，重复实验1次，并记录K+电流的变化。实验分3组，未经过电化学治疗的Hela细胞，以及经过（5V，10C）的电化学剂量治疗的阳极及阴极细胞，每个实验组记录的细胞个数为5个，实验重复3次。
1.4 RT-PCR 用Trizol试剂盒提取电化学治疗前后宫颈癌Hela总RNA，紫外分光光度仪测OD260/OD280比值，均大于1.8，说明所提RNA符合要求；将RNA定量为1 μg/μl，反转录成cDNA引物序列，目的基因引物S：5’ CAG TGA AGG GAG GAT GAC 3’；A：5’ CGA ACT GGT GGT GCT TTT 3’；内参GAPDH基因引物S：5’GAA GGT GAA GGT CGG AGT 3’；A：5’GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3’，按下列程序进行PCR反应，94 ℃预变性5 min，然后以94 ℃变性1 min、54 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min进行27次循环，最后以72 ℃延伸10 min。取5 μl RT-PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析。以GAPDH基因作为内参照，计算机灰度扫描求积定量，计算目标条带与GAPDH灰度比值。
1.5 活细胞计数法测电化学对宫颈癌细胞生长曲线的影响 将细胞分为5组：正常对照组，电化学治疗后阴极组及阳极组，电化学治疗并用含钾通道开放剂比那地尔的培养液培养的阴极组和阳极组。台盼蓝染色后，倒置显微镜下观察计数晶莹透亮、形态完整细胞。计数细胞计数板四个角方格内细胞总数。按公式：
细胞密度=四角16方格内细胞总数 4×10000计算3孔细胞数取平均值，以减少误差，并以细胞数为纵轴、时间为横轴做生长曲线图。
1.6 统计学方法 所有实验重复3次，所得数据用统计软件SPSS 13.0处理，以均值±标准差(x±s)表示，成组设计单因素方差分析两样本均数间两两比较。
2 结果
2.1 全细胞膜片钳实验检测Hela细胞的K+电流 每一检测细胞均检测出外向K+电流(Ik)。细胞的Ik在200 ms的检测电压过程中不灭活，对溶液中加入TEA-CL敏感。当对照组Ik阶跃电压至+ 50 mV时，被诱发出的Ik为（1.22±0.11）nA，被检测的细胞数为10个细胞;当分别在这些细胞的溶液中加入20 mmol/L的TEA-CL时，Ik即降低到（0.57±0.10）nA，减少了52%(P<0.01），用正常外液灌流该电流后恢复，证实该外向电流为K+电流（见图1）。而经过（5V，10C）电化学治疗后，阴极处细胞+50mV被诱发出的Ik为（0.96±0.10）nA，减少了21%(P<0.05)，I-V曲线下移;阳极处细胞+50 mV被诱发出的Ik为（1.02±0.10）nA，减少了18%(P<0.05)，I-V曲线下移(见图2)，每组所检测的细胞数为10个。
2.2 RT-PCR电泳结果 结果显示，在402Bp和226Bp处可见清晰的扩增条带，分别为电压门控型K+通道KCNJ16以及内参照GAPDH。经凝胶成像系统光密度扫描仪分析各组标本，计算目标条带与内参照的A比值，发现经电化学治疗阴极和阳极的表达量低于正常组细胞，见表1、图3。表1 RT-PCR电泳结果注：与对照组比较，*P<0.01，**P<0.05
2.3 电化学治疗对宫颈癌Hela细胞生长曲线的影响 结果提示：经过电化学治疗后阴极及阳极的细胞7天内的生长曲线比未经过治疗的细胞组明显下移，而在电化学治疗后予K+通道开放剂比那地尔的培养液培养的阴极及阳极细胞组，其7天内的生长曲线比电化学治疗后用普通培养液培养的阴极及阳极细胞组有明显上移（见图4）。图4 细胞生长曲线图
3 讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其治疗方法主要为以放疗、化疗为主的综合治疗，而对于不能手术、放疗或化疗无效的患者，电化学治疗可达到临床治愈、止痛、缓解症状、延长生命的治疗效果，成为重要的辅助治疗手段［2］。电化学治疗是根据Nordemstrom提出的血管—间质闭合电路，利用直流电场脉冲电流，强制性地改变肿瘤细胞的微环境，从而使肿瘤细胞丧失生存环境而死亡的新疗法［2］。
近年来，由于膜片钳技术的发展，使人们对生物体的电现象和其生命现象有了进一步的了解，形成了许多病因学和病理学方面的新观点，在离子通道与肿瘤关系的研究中，K+通道是研究得最多的。众多研究表明，细胞膜上K+通道活性在细胞的有丝分裂中起重要作用［4］。并有K+通道和人体肿瘤细胞增殖关系的研究证实，K+通道阻滞剂可抑制人的结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞以及神经鞘瘤中Schwann细胞的增殖，并可诱导肝癌细胞的凋亡［5～7］。
本实验以此为基础，分别运用膜片钳技术和RT-PCR技术研究电化学治疗对宫颈癌Hela细胞K+通道电流功能及其基因表达的影响，结合细胞计数功能实验，分析电化学治疗对K+通道的影响与其杀瘤机制之间的关系。由此证明了电化学治疗后阴极及阳极的细胞K+通道电流强度减弱，其相关基因表达减弱，所以电化学治疗对Hela细胞K+通道有抑制作用，而加入K+通道开放剂解除这种抑制后，在生长曲线上表明电化学对Hela细胞的杀伤作用也因此减弱。
笔者认为，电化学对宫颈癌Hela细胞的抑制杀伤作用可能会有如下机制：（1）抑制了K+通道，改变了细胞静息电位，改变了细胞基本生理特征；（2）抑制了K+通道，从而抑制了Hela细胞膜上动作电位的产生，改变了细胞膜上最基本的生理特征，使细胞增殖受到抑制；（3）降低了细胞膜上K+通道相关蛋白的表达程度使细胞增殖受到抑制［6，8］。
总之，电压门控性钾通道在Hela细胞增殖中起重要作用，电化学治疗可以通过抑制电压门控性K+通道抑制Hela细胞的增殖。
【参考文献】
1 Yang K，He M，Wang Z，et al.Electrotherapy and its mechanism for sarcoma of KM mice，Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi，2005，22(5):914-917.
2 Tang BJ，Lili，Jiang Z，et al.Characterization of the mechanisms of electro-chemotherapy in an in vitro model for human cervical cancer.J Oncol，2005，26（3）：703-711.
3 O’Grady SM，Lee SY.Molecular diversity and function of voltage-gated (Kv) potassium channels in epithelial cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（4）：704-709.
4 Kros CJ.How to build an inner hair cell:Challenges for regeneration.Hear Res，2007，227（1-2）：3-10.
5 Lex TS，Chang CS，Fang KP，et al.The involvement of K(v)3.4 voltage-gated potassium channel in the growth of an oral squamous cell carcinoma cell line.J Pharmacol Exp Ther，2004，311（3）:1105-1114.
6 Farias LM，Ocana DB，Diaz L，et al.Ether a go-go potassium channels as human cervical cancer markers.Biochem Biophys Res Commun，2004，316（1）：244-251.
7 Fieber LA，Gonzelez DM，Wallace MR，et al.Delayzed rectifier K currents in NF1 Schwann cells.Pharmacological block inhibits proliferation.Neurobiol Dis，2003，13(2):136-146.
8 Yabushita H，Yoshikawa K，Hirata M，et al.Effects of electrochemotherapy on CaSki cells derived from a cervical squamous cell carcinoma.Gynecol Oncol，1997，65（2）：297-303.
作者单位：530021 广西南宁，广西医科大学附属肿瘤医院