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【摘要】 目的 探讨放射对宫颈癌Hela细胞系再增殖的影响，为宫颈癌是否有必要实行非常规分割放疗提供一定的理论基础。方法 在不同剂量的放射作用下，以台盼蓝染色细胞计数法分析Hela在照射后不同时间点的潜在倍增时间的变化；以克隆形成实验检测其同期克隆源性细胞存活比率，并将两者结合分析。结果 （1）Hela细胞在照射后的确出现Tpot的缩短。（2）在0～8Gy剂量范围内，单次照射剂量越大，其照射后的细胞的Tpot就越短（P<0.01）。（3）照射后细胞的Tpot变化与残存克隆源性细胞的加速再增殖的能力成正相关（r=0.8918）。结论 （1）Hela细胞在照射后会出现加速增殖，且加速增值的程度可能与剂量有关。（2）放射后Hela细胞的加速再增殖可能与其自身调节有关。
【关键词】 Hela；肿瘤细胞加速增殖；辐射性效应
Dynamic change of the auxesis of cervix carcinoma Hela after Co-60 radiotherapy
LIU Yan，HUANG Wei，LI li，et al.Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China
［Abstract］ Objective To explore the effect of radiotherapy on the auxesis of Hela cell in cervix carcinoma to offer the theory elements to identify whether or not the cervix carcinoma would be treated by radiotherapy with non-routine segmentation.Methods After radiotherapy with different doses,the Hela cells changes of potential doubling time by cytometry with trypanblau coloration were analysed,and the livability of clonogenic cell at the same time was detected by clone,and the two former were combined to aralyse the changes.Results （1）Tpot shortening was observed in Hela cell after radiotherapy.（2）The more the dose per time,the shorter Tpot of postradiative cell,within 0～8 Gy.（3）Tpot change of postradiative cell is correlative positively to the function of accelerating the reproductive ability of remaining clonogenic cell （r=0.8918）.Conclusion （1）Hela cell will be accelarated reproduction after radiotherapy,whose degree is probably correlative to the dose.（2）The reproductive speedup of postradiative Hela cell relates to the self-regulation.
［Key words］ hela；carcinoma cell;reproduction
放射治疗的成败取决于它的辐射性生物学效应。当前放射生物学家在对一些肿瘤细胞，特别是头颈部肿瘤细胞的研究中证实［1，2］，在常规分割放射治疗过程中，残存的肿瘤干细胞会出现加速再增殖，而这种加速增殖是导致肿瘤放射治疗失败的重要原因之一［3］。宫颈癌是严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤，放疗是中晚期宫颈癌的主要治疗方式，目前也取得一些成效，但是仍有50%以上的宫颈癌放疗后会出现复发，因此寻找到更好的放疗方案就显得至关重要［4］。目前检测细胞放射后是否出现加速增殖的直接指标就是检测其克隆源性细胞的增殖能力，可以间接通过肿瘤细胞潜在性倍增时间（potential doubling time，Tpot）的变化来确定［5］。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人宫颈癌Hela细胞珠由中科院上海细胞生物研究所提供，我院实验室传代培养。使用RPMI-1640培养液（美国GIBCO公司），其中加入100 μ/ml青霉素和100 μ/ml链霉素，同时加入20%小牛血清（杭州四季青公司），置37 ℃、5%CO2培养箱内。
1.2 细胞生长曲线和Tpot的测定 在六孔板中培养细胞，每孔加入指数生长期Hela细胞1×104，每三孔为设为一组，每个照射剂量共6组（即6天）。每日取一组收集原培养液和消化后冲洗液，离心弃上清，沉淀用PBS（0.01 M，pH 7.4）洗涤一次后，再用0.5～1 ml PBS液进行悬浮，台盼蓝染色2 min后运用细胞计数板和相差显微镜进行细胞计数，不被染色的细胞作为活细胞，染蓝的细胞作为死细胞。细胞总数=活细胞+死细胞；活细胞比率=活细胞/细胞总数。潜在倍增时间（Tpot）计算方法：Tpot=Tc×（1-φ）［6］。其中φ为细胞丢失因子，φ=1-活细胞比率；Tc为细胞倍增时间（即培养的细胞总数增加一倍所需时间），Tc=ln2×Δt/ln（N2/N1）；Δt为两次细胞计数的时间间隔（单位小时或天）；N1、N2分别为前、后两次细胞计数时活细胞的数量；ln（2）=0.693。在此计算中考虑了死细胞因素，即细胞丢失因素。以此计算出活细胞比率，并进一步推算出Tpot。
1.3 克隆形成率（cloning forming efficiency）的检测 采用平板克隆形成实验，将处于指数生长期的Hela细胞接种于小号培养瓶中（用记号笔将瓶底平均分为9格，一格设为一个计数范围），接种密度为500个/瓶，细胞被均匀打散分布于瓶中。每两瓶设为一个剂量组（共10瓶），照射后每天在倒置显微镜下观察计数细胞的克隆形成情况，观察范围为每个小瓶中心十字形的5个小格，即每个照射剂量计数10个小格。单细胞增殖生成大于50个细胞的细胞团称为一个克隆细胞株。统计数据计算细胞克隆形成率。克隆形成率=实验组的克隆形成数/对照组的克隆形成率。
1.4 放射对于细胞潜在倍增时间的影响 我们采用实验组细胞潜在倍增时间与对照组细胞的潜在倍增时间的比来进行分析比较；而Tpot与放射后Hela克隆源性细胞再增殖的关系：对“不同照射剂量组Tpot/对照组Tpot的比值”与“不同照射剂量下克隆细胞生存率”进行直线相关分析。
1.5 放射方法 放射处理采用钴-60远距离治疗机（Canada THERATRONICS）。于室温空气中照射，源靶距80 cm，剂量率108～111 cGy/min，选用5个剂量点，即对照组0 Gy，实验组2、4、6、8 Gy单次照射。
1.6 统计学方法 本实验中统计学处理采用方差分析、团体t、直线相关分析等。所有实验均重复3次，以SPSS 13.0软件进行统计。
2 结果
2.1 Hela潜在倍增时间的测定 通过以上计算方法我们最终得出指数生长期未照射的Hela细胞Tpot约为21.48 h。其中Tc为23.35，而整个生长过程中对照组的活细胞比率为（0.92±0.05）（n=6）。
2.2 放射对细胞增殖动力学的影响 随着放射剂量增大，除2 Gy组在6天内与对照组相比统计学上尚无差异（P>0.05），其余组Hela细胞Tpot程进行性缩短（P<0.01）。其中8 Gy组由于后续时间细胞几乎全部死亡，因此只测到3天的值，见图1。
2.3 放射后克隆源性细胞增殖变化 放射后，Hela细胞的克隆形成率随即减少。通过对不同放射剂量下Hela细胞存活比率和其Tpot的相关分析，得出这段时间内Hela细胞存活比率的减少和Tpot的减小密切相关（r=0.8922），见图2。
3 讨论
随着放射生物学的进展，越来越多的细胞、动物实验和临床资料表明，一些肿瘤细胞在放射后会出现加速再增殖，而这又往往是许多肿瘤常规分割放疗失败的主要原因之一［7，8］。因此了解肿瘤细胞增殖动力学的变化，对于改进肿瘤放疗方案具有重要的指导意义。有关细胞增殖动力学的指标目前也比较多，诸如细胞S期持续时间（Ts）、S期细胞比例（SPF）、DNA倍体、Tpot、克隆细胞形成率等，其中以潜在倍增时间、细胞克隆形成率的意义最得到大家的认可。从上述的实验结果我们得知，宫颈癌Hela细胞系在放射后出现Tpot缩短，这也提示了Hela在放射后有细胞增殖动力学的改变。
据目前的研究证明不同的肿瘤细胞其潜在倍增时间相互差异很大［9］。而肿瘤细胞群体的倍增能力一般与其克隆源性细胞的再生能力密切相关。从此实验可知宫颈癌细胞株在照射后的加速增殖能力与照射剂量有关。照射剂量越大，肿瘤的Tpot就越小，克隆细胞增殖一倍的时间就越短，细胞增殖就越快。除2Gy照射组在所测时间按内Tpot的改变没有明显的统计学意义（P>0.05），其余剂量均有明显的统计学意义（P<0.01），考虑2Gy组的结果可能是测量时间较短所致。因此在宫颈癌的放射治疗中寻找更合适的放疗方案有可能会进一步控制宫颈癌的复发。
Tpot和克隆细胞生成率的相关分析表明放射剂量引起的Hela细胞存活比率的减少与Tpot的缩短呈密切相关（r=0.8922）。这提示放射后肿瘤的加速再增殖可能是细胞群本身代偿调节所致。这可能有两方面的原因：（1）放射后破坏的肿瘤细胞可能会产生或释放某种物质，与其周围的克隆源性细胞发生系列反应，加强了残存细胞的增殖能力。（2）放射后肿瘤细胞大量死亡，残存细胞的生长空间增大，可能减少了细胞间的接触抑制作用。当然除了肿瘤细胞本身自身调节外，其他因素如细胞营养状况、细胞丢失和补充因素不可忽略。
【参考文献】
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3 易俊林，高黎，黄晓东，等.鼻咽癌放射治疗的失败模式.中华放射肿瘤学杂志，2004，13:145-148.
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作者单位：530021 广西南宁，广西医科大学附属肿瘤医院