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【摘要】 目的 应用动物模型探讨蜱传病原体伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无浆体混合感染对Th1型细胞因子产生的影响。 方法 建立三种伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无浆体混合感染小鼠模型和伯氏疏螺旋体单一感染小鼠模型。将小鼠分A组（同时感染组）、B组（伯氏疏螺旋体先于嗜吞噬细胞无浆体感染组）、C组（嗜吞噬细胞无浆体先于伯氏疏螺旋体感染组）、D组（伯氏疏螺旋体单感染组）和E组（无感染对照组）等共5组，每组16只，在不同时间点测定各组小鼠血清Th1型细胞因子浓度，并对数据进行统计学分析。 结果 与单一感染组相比，在螺旋体感染后18d和30d，三种混合感染组小鼠血清中Th1型细胞因子显著偏低。 结论 伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无浆体混合感染显著抑制Th1型细胞因子产生。
【关键词】 混合感染 伯氏疏螺旋体 嗜吞噬细胞无浆体 莱姆病 细胞因子
Effect of coinfection with Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum on inhibition of production of Th1 cytokines in the murine host.
BAO Fu-kai,Erol Fikrig.
(Department of Microbiology and Immunology, Kunming Medical College, Kunming 650031,Yunnan,P. R. China; Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06511, USA)
Abstract：Objective To determine the effect of coinfection of Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum on the production of Th1 cytokines in the sera. Methods Eighty female C3H mice were randomly divided into 5 groups, including 3 coinfected groups with Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum, 1 single Borrelia burgdorferi-infected group,and 1 negative control group.The mouse models co-infected with Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum and the single Borrelia burgdorferi-infected mouse model were established separately, Th1 cytokines in the sera at two time points in different groups of mice were determined and compared statistically. Results Compared to the single-infected group, the level of Th1 cytokine（IL-2,IL-12 and IFN-γ） in coinfected groups significantly decreased 18th day and 30th day after Borrelia burgdorferi infection. Conclusion Co-infection of Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum can significantly inhibit the production of Th1 cytokines in the murine host.
Key words：Co-infection; Borrelia burgdorferi; Anaplasma phagocytophilum； Lyme disease; Real time quantitative PCR
蜱传伯氏螺旋体感染与嗜吞噬细胞无浆体感染是两种新发蜱传传染病，分别称为莱姆病和嗜吞噬细胞无浆体病。蜱是一类专性寄生的节肢动物,其中以硬蜱种类最多。多种蜱类均具有传播不同病原体的能力［1］。近年来，蜱传病原体感染的研究取得一系列进展，对蜱传病原体混合感染的研究也得到不少有价值的发现。目前，蜱传病原体混合感染研究的主要对象包括对伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi,BB，莱姆病病原体)、微小巴贝虫(Babesia microti，BM)、埃立克体(Ehrlichia)和嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum，AP, 包括嗜粒细胞埃立克体)。其中以BB和AP的混合感染报道较多［2］。
蜱传伯氏螺旋体与嗜吞噬细胞无浆体混合感染的研究。Krause等［3］报道，与LB患者相比，BB与AP混合感染的患者症状更多、更严重，持续时间更长，在血标本中检出BB DNA的可能性更大。Ramsey等［4］（2002）报道了BB和AP混合感染的临床后果发现与AP单一感染相比，BB与AP混合感染可加重急性期症状，但与急性期之后的症状持续时间无关。由于人群的混合感染研究受很多因素的限制，因此，建立混合感染动物模型对深入研究混合感染的致病机理、发病过程与临床后果具有重要意义［2］。为此，我们在从前建立了建立蜱传病原体BB和AP混合感染的动物模型，并发现二者混合感染可使小鼠组织螺旋体载量显著增高，关节炎明显严重，血清IgG效价显著偏低的基础上［5］，进一步探索BB和AP混合感染对宿主Th1细胞因子产生的影响和加重莱姆病症状的原因。
1 材料和方法
1.1 主要仪器和试剂 MJ-PTC200型PCR仪（MJ Research，USA）；BioRad Model 3550酶标仪（BioRad，Ca，USA）；Gel Doc 100凝胶成像仪(Bio-Rad laboratories，Hercules，CA，USA)、Sigma 1－15型离心机（Sigma，USA）；Eppendorf Centrifuge 5415D小型离心机（Eppendorf，USA）；Thermo Forma CO2培养箱（Thermo，MA，USA）；Thermo Forma深低温冰箱（Thermo，MA，USA）；岛津（Shimadzu）UV2550型紫外可见分光光度计（Shimadzu，Japan）；DNAeasy DNA提取试剂盒（Qiagen，CA，USA）；Taq DNA聚合酶（Roche，USA）；dNTP（New England Biolabs，USA）；羊抗鼠IgM酶标第二抗体、羊抗鼠IgG酶标第二抗体（Sigma，USA）；PCR引物（Keck中心，耶鲁大学，USA）；大鼠抗小鼠IFN-γ抗体、生物素化大鼠抗小鼠IFN-γ抗体、重组小鼠IFN-γ标准品，大鼠抗小鼠IL-2抗体、生物素化大鼠抗小鼠IL-2抗体以及重组小鼠IL-2标准品，大鼠抗小鼠IL-12抗体、生物素化大鼠抗小鼠IL-12抗体、重组小鼠IL-12(p40)标准品(BD Biosciences,CA,USA)。
1.2 菌株及供试菌液 低传代（3代）伯氏疏螺旋体（BB）B31株5A11克隆引种自德克萨斯大学Steven Norris实验室，为广泛应用的毒株。螺旋体在实验室中大量增菌一次，然后将培养物以每份50μl分装到菌株储存瓶中，加等量甘油后，置于－80℃低温冰箱长期保存备用。在动物实验前，取一份储存菌株接种到含5ml BSK-H完全培养液的带旋盖的15ml培养管中，置于37℃、CO2浓度为5％的CO2培养箱中培养，第7d后每日取培养物在细菌计数板计数，当螺旋体增值至对数生长期末期，浓度达到1×107/ml时终止培养,用PBS将螺旋体菌液浓度调整为1×105/ml备用［6,7］；嗜吞噬细胞无浆体（AP）分离株NCH－1来源于美国马萨诸塞州的一名感染者，已证实其在小鼠中的感染性［8］。在动物实验前，取低温保存的无浆体菌株（100μl）注入5只四周龄C3H/HeJ SCID免疫缺陷小鼠（美国Jackson实验室）腹腔中增菌。在注射5d后从小鼠眼内眦取血，通过染色检测中性粒细胞质中的桑椹体和PCR检测血中无浆体p44 基因DNA证实感染成功。所用p44基因(GenBank进入号：AF037599)引物为：正向引物5ˊ-AGA-AGA-ATG-GGG-GTT-CTC-GT-3ˊ, 逆向引物5ˊ-GTT-CAC-ACT-GCC-ATC-ACC-AC－3ˊ 。高浓度Ap在SCID小鼠体内至少可维持3个月。在动物实验时，直接从感染SCID小鼠内眦取血进行实验［9,10］。
1．3 小鼠及小鼠实验［11,12］ 所有四周龄无特殊病原体（SPF）C3H/HeJ实验小鼠均购自美国缅因州Jackson实验室。小鼠达到后立即饲养在ABSL－2动物实验室中，由专门饲养人员管理，观察1周无异常方可进行实验。小鼠分5组，每组16只。A组（同时感染组）：在第0天同时造成BB和AP的感染，在每只小鼠下背部皮内注射1×105 Bb菌液100μl，腹腔内注射Ap感染的SCID小鼠血100μl。B组（BB先于AP感染组）：在第0d在每只小鼠下背部皮内注射1×105 BB菌液100μl，第7d腹腔内注射AP感染的SCID小鼠血100μl。C组（AB先于BB感染组）：在第0d每只小鼠腹腔内注射AP感染的SCID小鼠血100μl，第7d背部皮内注射1×105 BB菌液100μl。D组（BB单感染组）：在第0d在每只小鼠下背部皮内注射1×105 BB菌液100μl。E组（无感染对照组）：在每只小鼠下背部皮内注射PBS 100μl，腹腔内注射正常SCID小鼠血100μl。在第13d取各组小鼠内眦血，Qiagen DNAeasy试剂盒抽提总DNA，检测DNA含量和纯度，用MJ Research PTC200型PCR仪进行PCR检测Ap感染；取耳组织Qiagen DNAeasy试剂盒抽提总DNA，用同型号PCR仪做PCR检测BB感染，以判断实验性感染成功与否。
1.4 血清标本收集 在伯氏疏螺旋体感染后第18d(莱姆病急性期)和第30d（莱姆病慢性期），取心血，血液置常温分离血清、编号，－20℃储存用于细胞因子检测。
1.5 抗原捕获ELISA测定血清细胞因子
1.5.1 标准曲线制作及ELISA方法 将重组小鼠IFN-γ（10μg）用稀释液（BD Biosciences提供）稀释为7个浓度: 2000.00pg/ml、1000.00pg/ml、500.00pg/ml、250.00pg/ml、125.00pg/ml、62.50pg/ml、31.25pg/ml,并以稀释液作为0浓度制定IFN-γ标准曲线。另将重组小鼠IL-2（20μg）和用稀释液（BD Biosciences提供）分别稀释为8个浓度: 1000.00pg/ml、500.00pg/ml、250.00pg/ml、125.00pg/ml、62.50pg/ml、31.25pg/ml、15.60pg/ml、7.80pg/ml,并以稀释液作为0浓度,制定IL-2标准曲线。用包被液将IFN-γ（大鼠抗小鼠IFN-γ抗体）、IL-2或IL－12捕获抗体（大鼠抗小鼠IL-2抗体）稀释为使用浓度1μg/ml，向96孔ELISA板每孔加100μl捕获抗体100μl，密封膜密封，4℃包被过夜（12h）。第2d早晨倾去包被液，用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗3次，用封闭液（5％脱脂牛奶）室温封闭2h，倾去封闭液，加100μl不同浓度的标准品，每个浓度加两个复孔，37℃作用1h。用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗5次，加100μl生物素化大鼠抗小鼠IFN-γ抗体和生物素化大鼠抗小鼠IL-2抗体，37℃作用1h，再用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗5次，加100μl链亲合素辣根过氧化物酶，作用45min，清洗5次，加底物TMP 100μl,室温避光反应30min，加100μl终止液终止反应。将酶标板放入BioRad 3550型酶标仪（BioRad Laboratries）,在450nm测定各孔OD值，用BioRad ELISA数据分析软件（Microplate Manager Data Analysis Software）进行数据收集、输出和整理。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用标准曲线制作软件作标准曲线。IFN-γ的曲线方程为y＝0.0014x+0.0146,相关系数r＝0.9984。IL-2的曲线方程为y＝0.0059x+0.1566,相关系数r＝0.9970。IL-12的曲线方程为y＝0.0023x-0.0109,相关系数r＝1.0000。
1.5.2 血清细胞因子的捕获ELISA检测 为了检测血清IFN-γ含量，用包被液将IFN-γ捕获抗体（大鼠抗小鼠IFN-γ抗体）稀释为使用浓度1μg/ml。向96孔ELISA板每孔加100μl捕获抗体100μl，密封膜密封，4℃包被过夜（12h）。第2d早晨倾去包被液，用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗3次，用封闭液（5％脱脂牛奶）室温封闭2h，倾去封闭液，加100μl血清样品，每个样品加两个复孔，37℃作用1h。用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗5次，加100μl生物素化大鼠抗小鼠IFN-γ抗体，37℃作用1h，再用缓冲液（0.05% Tween20的PBS）清洗5次，加100μl链亲合素辣根过氧化物酶，作用45min，清洗5次，加底物TMP 100μl,室温避光反应30min，加100μl终止液终止反应。 将酶标板放入BioRad 3550型酶标仪（BioRad Laboratries）,在450nm测定各孔OD值，用BioRad ELISA数据分析软件（Microplate Manager Data Analysis Software）进行数据收集、输出和整理。取样品复孔OD的平均值，代入IFN-γ的标准曲线方程y＝0.0014x+0.0146,求出各样品中的IFN-γ含量。血清IL-2和IL－12（p40）含量的检测方法与IFN-γ检测方法类似。
1.6 资料统计方法 所有资料均用生物医学专用统计软件GraphPad Prism version4（Prism 4）（GraphPad Software INC.,San Diego, CA, USA）处理。血清细胞因子浓度比较用单因素方差分析（one way ANOVA）,并用Tukey氏多重比较检验（Tukey’s multiple comparison test）进行事后检验（Post hoc test）。P<0.05表示差别有显著性，P<0.01表示差别有高度显著性。
2 结果
2.1 混合感染对IFN-γ和IL-2产生的影响 在伯氏疏螺旋体感染的第18d，混合感染组（A、B和C组）血清IFN-γ浓度显著低于单一感染组（P<0.001）,而三个混合感染组之间血清IFN-γ浓度无明显差别。在伯氏疏螺旋体感染的第30d，混合感染组（A、B和C组）血清IFN-γ浓度仍低于单一感染组,但差别无显著性。在伯氏疏螺旋体感染的第18d，混合感染组（A、B和C组）血清IL-2浓度显著低于单一感染组（P<0.01）,而三个混合感染组之间血清IL-2浓度无明显差别。在伯氏疏螺旋体感染的第30天，混合感染组（A、B和C组）血清IL-2浓度仍显著低于单一感染组。A组与D组相比(P<0.01); B、C组与D组相比(P<0.05),表1、2。
表1 伯氏螺旋体感染后18d小鼠血清IFN-γ和IL-2浓度(pg/ml)（略）
Tab 1 IFN-γand IL-2 concentrations in the murine serum samples after 18-day infection
注：与D组比较，P<0.01,P<0.05。
2.2 混合感染对IL-12产生 在伯氏疏螺旋体感染的第18d，混合感染组（A、B和C组）血清IL-2浓度显著低于单一感染组（P<0.001）,而三个混合感染组之间血清IFN-γ浓度无明显差别。在伯氏疏螺旋体感染的第30d，混合感染组（A、B和C组）血清IFN-γ浓度仍低于单一感染组，但差别无显著性（图1、2）。
图1 伯氏螺旋体感染后18d各组小鼠血清IL-12(p40)浓度（略）
Fig 1 IL-12(p40)concentration in the murine serum samples after 18-day infection
***P<0.001
图2 伯氏螺旋体感染后30d各组小鼠血清IL-12(p40)浓度（略）
Fig 2 IL-12(p40)concentration in the murine serum samples after 30-day infection
3 讨论
3.1 立题依据 已知硬蜱是多种病原体的共用传播媒介，一只蜱内可同时检测出两种、甚至两种以上病原体。多项研究也已经证明，蜱传病原体可引起人和动物的混合感染。对蜱传病原体混合感染的研究则刚刚起步，对混合感染的发生机理和致病机理、对免疫系统和免疫应答的影响以及临床过程和临床后果等尚待进一步研究。在蜱传病原体的混合感染中，伯氏疏螺旋体与嗜吞噬细胞无浆体混合感染较为常见［11，12］。
1986年Mosmann等根据小鼠的CD4+ T细胞克隆产生细胞因子类型的不同，将CD4+ T细胞发为TH1和TH2两种类型，随后Romagnani等人证实体内出存在相应的TH1和TH2亚群［1,2］。Th1细胞主要产生如白细胞介素2（IL-2）、IL-12、干扰素γ（IFN-γ）等，可以增强杀伤细胞的毒性作用，激发迟发型超敏反应，介导细胞免疫应答；TH2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-10，促进抗体的产生，介导体液免疫应答［13］。研究已表明，严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（T、B淋巴细胞联合缺陷）不能有效清除伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞感染，细胞免疫和体液免疫在清除伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞感染中均发挥作用。
我们从前建立了建立蜱传病原体BB和AP混合感染的动物模型，并发现二者混合感染可使小鼠组织螺旋体载量显著增高，关节炎明显严重，血清IgG效价显著偏低。因此，本研究项目以伯氏疏螺旋体与嗜吞噬细胞无浆体混合感染可能存在的三种模式为依据，分别建立小鼠混合感染模型，并与单一伯氏疏螺旋体感染作比较，研究伯氏疏螺旋体与嗜吞噬细胞无浆体混合感染对Th1型细胞因子产生的影响，从而进一步探索混合感染加重莱姆病症状的原因。
3.2 混合感染抑制Th1型细胞因子产生 已有充分的证据表明，AP可抑制骨髓造血，严重干扰宿主固有免疫功能，特别是中性粒细胞功能，而固有免疫是适应免疫发生的前提。固有免疫受损必然导致适应性免疫受损［14，15］。本研究表明，混合感染显著抑制宿主Th1型细胞因子的产生。IL－12是促使Th0细胞分化为Th1细胞的主要因子，而IFN-γ和IL-2是体内与细胞免疫功能相关的两种重要细胞因子。本研究表明，与单一BB感染相比，混合感染显著抑制宿主的IL12、IFN-γ和IL-2产生，从而影响细胞免疫功能的发挥。
BB和AP混合感染时存在明显协同作用，表现为：明显增加组织螺旋体载量，加重莱姆关节炎，抑制抗螺旋体抗体产生［5］。二者发挥协同作用的方式尽管十分复杂，但Ap抑制宿主体液和细胞免疫功能，使宿主对Bb更易感和更易在体内增殖，可能是重要协同方式之一。本研究的结论对探索Bb和Ap混合感染的致病机理、预防和治疗有一定意义。
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作者单位：昆明医学院微生物学与免疫学教研室,云南 昆明 650031