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【摘要】 目的 研究利用Pin1反义核酸阻断乳腺癌MCF-7细胞中Pin1的表达，并观察其对增殖的影响。 方法 构建Pin1反义核酸真核表达质粒pPIN1as，用脂质体转染法将重组质粒转染MCF-7细胞，G418筛选稳定表达重组质粒的克隆，RT-PCR检测Pin1基因表达水平，Western blot检测Pin1蛋白的表达，MTT检测细胞增殖状况。 结果 稳定表达Pin1反义核酸的MCF-7细胞内Pin1基因表达在mRNA水平和蛋白水平都显著降低；MTT实验显示MCF-7PINAS细胞的增殖速度较MCF-7细胞明显减慢(P<0.05)。 结论 阻断Pin1可以显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性，这为乳腺癌的基因研究及治疗提供了新思路。
【关键词】 Pin1 反义核酸 乳腺癌
Effect of P1N1 antisense nucleotide on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7.
HU Chun-xia, ZHOU Jin-hua, ZHU Tao, et al.
(Molecular Tumor Center, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei, P. R. China；Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou,570102, P.R. China)
Abstract：Objective To observe the effect of Pin1 antisense nucleotide on cell proliferation of human breast cancer cell line MCF-7. Methods The eukaryotic vector named pPINas, expressing Pin1 antisense nucleotide, was constructed. MCF-7 was transfected with pPINas and selected in the culture with G418. The selected clone MCF-7PINAS was checked for expression of Pin1 by RT-PCR and Western blot. The proliferation of cells in clone MCF-7PINAS were investigated by MTT. Results The expression of Pin1 at mRNA and protein level in MCF-7PINAS clone was down-regulated remarkably. MTT showed the proliferation of MCF-7PINAS was significantly retarded contrasting to MCF-7 (P<0.05). Conclusion Blocking the expression of Pin1 with antisense nucleotide can signficntly depress the proliferation activity of MCF-7 to have offered new insight in gene research and treatment of human breast cancer.
Key words：Pin1; Antisense nucleotide; Breast cancer
PIN1(Peptidyl-Prolyl Cis/Trans Isomerase,NIMA-interating,1)是一种肽脯氨酰顺反异构酶，能够特异性地识别磷酸化后的丝/苏脯氨酰基序，而蛋白序列中丝/苏脯氨酰基序的磷酸化是一个重要的细胞内信号机制，它主要关系到细胞的增殖和转化。Pin1特异性识别并催化磷酸化的丝/苏脯氨酰，使蛋白质发生顺反异构反应，从而调节蛋白的功能。这种复杂信号机制的失调可导致细胞转化和肿瘤发生［1］。近年来发现Pin1在人类多种肿瘤组织中存在Pin1基因过度表达［2］。在乳腺癌、前列腺癌中高表达并提示预后不良［3,4］。因此，有学者认为Pin1可能成为癌症治疗的新靶点［5］。本文应用反义核酸技术，构建了携带Pin1反义核酸的真核表达载体pPINas，转染乳腺癌MCF-7细胞，观察细胞的增殖活性，探讨Pin1反义核酸用于乳腺癌基因研究和治疗的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料 MCF-7细胞株购自ATCC并由本实验常规保存，真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α株购自天为时代公司。各种限制性内切酶购自大连宝生物公司，脂质体转染试剂Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品,T4DNA连接酶及Trizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV)、耐热DNA聚合酶（Taq酶）均购自Promega公司。兔抗人Pin1多克隆抗体购自Santa Cruz公司。G418购自Sigma公司。所有引物均用Oligo软件自行设计。 PCR引物合成及DNA测序由上海英骏生物技术公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和Pin1反义核酸真核表达质粒的构建 MCF-7乳腺癌细胞系采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置37℃，5%CO2培养箱常规培养，收获对数生长期的细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录反应获得cDNA，反应条件为37℃ 60min。从Genbank获得Pin1 mRNA全长及编码区序列(Accession No. NM_006221)，设计扩增反义基因的引物：上游：5'-GC TCT AGA CTG CGG CAG GAG GGA AGA TG-3', 下游：5'-CG GGA TCC TCA GTG CGG AGG ATG ATG TG-3'，下划线分别为XbaI和BamHI的酶切位点，以达到定向插入的目的。扩增条件为：95℃预变性2min，94℃变性30s，64.3℃退火45s，72℃延伸45s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min，PCR产物长度为513bp。PCR纯化试剂盒回收纯化PCR产物，纯化产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用XbaI和BamHI双酶切，玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收，室温下连接3h，连接产物转化感受态细胞，铺板挑取阳性克隆，命名为pPIN1as，经酶切鉴定片断大小无误，送测序结果显示插入片断完全正确。
1.2.2 表达重组质粒的MCF-7细胞亚克隆的筛选及鉴定 采用Lipofectamine2000脂质体转染法, 将重组质粒pPIN1as和pcDNA3.1分别转染MCF-7细胞，按照说明书操作，并以未转染的MCF-7细胞做对照。转染后24h按照1:5传代，48h加入含有G418 1 000μg/ml的完全培养基进行压力培养，2～3d换液1次。两周后未转染对照组细胞完全死亡，实验组和空载体组改用含G418 400μg/ml的完全培养基维持筛选，直至挑出阳性克隆，用套环法挑取单克隆行扩大培养。鉴定阳性克隆方法为RT-PCR检测细胞中的Neo基因表达。Neo基因检测引物序列：上游：5'-AGA GGC TAT TCG GCT ATG AC-3'，下游：5'-GCT TCA GTG ACA ACG TCG AG-3'，扩增条件为：95℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸7min，PCR产物长度为211bp，表达反义重组质粒的阳性克隆命名为MCF-7PIN1as，表空载体的阳性克隆命名为MCF-7pcDNA。
1.2.3 RT-PCR检测Pin1 mRNA表达 用于Pin1基因表达检测的引物：P1：5'-TCA GGC CGA GTG TAC TAC-3'，P2：5'-CGG AGG ATG ATG TGG ATG-3'，扩增条件为：95℃变性30s，57.3℃退火30s，72℃延伸30s，产物长度为428bp。同时以GAPDH作为对照。用图像扫描分析系统HPIAS-1000测定各条带光密度值(AOD)，计算Pin1与GAPDH之比。
1.2.4 Western blot检测Pin1蛋白的表达 收集转染重组质粒、空白质粒和未转染质粒的MCF-7细胞，三去污裂解液分别提取细胞总蛋白并以考马斯亮兰(G250)法测定蛋白浓度，取100μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶37℃封闭1h， Pin1抗体4℃孵育过夜，相应二抗37℃孵育1h，按照ECL用增强化学发光显色系统显色。用Bio-Rad 公司一维图像分析系统测定条带灰度值，以β-actin作为等量蛋白上样对照，计算Pin1与β-actin之比，比较三组细胞中Pin1蛋白表达。
1.2.5 MTT检测筛选后细胞和正常细胞生长曲线 制备单细胞悬液，按3×103/孔的细胞密度分批接种于96孔板中，以细胞开始贴壁生长定为0，培养24、48、72、96和120h后分别往每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4 h后平板离心，弃培养液，每孔加入150μl DMSO轻摇15min溶解甲月赞结晶，酶标仪测定各孔570nm处吸光度值［6］。实验分为稳定表达PIN1as的细胞组、空载体组和未转染组，每组设4个复孔，计算同组处理样品A570平均值，绘制细胞生长曲线。
1.2.6 统计学分析 所有数据均用x±s表示，精确到两位小数，应用SPSS12.0版统计软件进行t检验和方差分析。
2 结果
2.1 反义基因真核表达质粒的酶切和鉴定 以MCF-7细胞的cDNA为模板，利用5’端含有XbaI和BamHI的引物扩增出长度为513 bp的Pin1 cDNA片断，酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1上，转化DH5α宿主菌，得到阳性克隆。pcDNA3.1和pPINas分别经XbaI和BamHI双酶切后行电泳，pPINas酶切电泳后在5366bp和503bp处分别可见载体片断和插入的PIN1的反义核酸片断(图1), 测序结果显示定向插入序列完全正确，表明成功构建了pPIN1as反义重组质粒。
图1 重组质粒酶切鉴定结果及G418筛选后阳性克隆Neo表达鉴定结果（略）
Figure1 Identification of recombinant pPINas by restrictive enzyme digestion and MCF-7PINAS by checking the expression of Neo
(A) M. 1kb DNA marker. 1. digested pcDNA3.1. 2. digested pPINas; (B) M. 100bp DNA marker. N. Neo G. GAPDH 1. pPINas transfected. 2. pcDNA3.1 transfected. 3. not transfected
2.2 PIN1反义重组质粒及空质粒转染阳性细胞亚克隆的筛选、鉴定 用脂质体法将反义重组质粒和对照空质粒分别转染MCF-7细胞，含G418的完全培养基培养直到挑出阳性克隆，反义重组质粒组和空白质粒组的阳性克隆中均检测出较高的Neo基因表达，而正常MCF-7细胞中则无Neo基因表达(图1)，说明成功筛选出稳定表达重组质粒的MCF-7细胞亚克隆。
2.3 转染反义重组质粒对MCF-7细胞Pin1基因表达的影响 RT-PCR和Western blot分别用于检测mRNA水平和蛋白质水平的表达。RT-PCR显示转染反义质粒后Pin1 mRNA表达水平比未转染组明显下降，相对积分吸光度值显示下降了64.7%；Western-blot显示转染反义质粒后Pin1 蛋白质表达水平也比未转染组显著下降，相对积分吸光度值显示下降了57%，而转染空质粒组PIN1表达在mRNA水平和蛋白水平与未转染组均无显著性差异(如图2)。
图2 三组细胞中Pin1在mRNA水平和蛋白水平的表达情况（略）
Figure 2 The expressions of Pin1 at mRNA and protein level in different cells
M: 100bp DNA Marker P. Pin1 G. GAPDH
1. not transfected; 2. pcDNA3.1 transfected; 3. PinAS transfected
2.4 转染反义重组质粒对MCF-7细胞增殖的影响 MTT法测定结果显示，转染反义质粒组MCF-7细胞增殖速度明显减慢，与未转染组比较有显著性差异，转染空质粒组与未转染组相比无显著性差异。结果证明，PIN1表达水平的下降可以导致细胞增殖速度明显减慢（图3）。
图3 三组细胞的生长曲线图（略）
Figure 3 The growth curve of different cells
X-axis. growth time Y-axis. The A570 value 1. not transfected; 2. pcDNA3.1 transfected; 3. PinAS transfected.
3 讨论
Pin1是一种作用底物广泛、作用位点明确并能增强许多致癌信号途径的功能酶,其过表达能增强Neu和Ras诱导的乳腺上皮细胞转化［7］。文献报道Pin1水平在人前列腺癌临床转移过程中起重要作用, 提示Pin1可能成为人侵袭性癌症治疗的标靶［8］。有研究表明，Pin1基因敲除的小鼠除了部分细胞增殖不良外能长至成年,这提示选择性抑制Pin1并无普遍毒性［9］。这说明Pin1在许多肿瘤疾病治疗、预后等方面可能发挥重要作用，进一步深入研究Pin1有着极其重要的意义。
近年来研究表明，依赖Pin1的丝/苏－脯氨酰顺反异构转变是新发现的蛋白磷酸化后信号转导机制［10～15］。这种顺反构型转变直接影响蛋白功能活性。研究显示，至少对某些底物而言，正是Pin1依赖的构型转变，而不是原始的磷酸化本身在调节蛋白功能，就如Cdc25c、CyclinD1和Tau蛋白显示的那样，Pin1对其稳定性、活性、亚细胞定位等多方面产生影响并导致结果一致，提示磷酸化特异性的肽基脯氨酰异构可能是一种计时机制，它允许细胞以一种高效而又精确的方式打开或关闭某些磷蛋白的功能。这种复杂信号机制的失调可导致细胞转化和肿瘤发生。丝/苏－脯氨酰基序是许多癌信号分子共同的致癌信号通路之一，丝/苏－脯氨酰磷酸化后可被Pin1特异性识别催化，构型转变后该类蛋白被充分激活且不被降解， Pin1放大致癌信号，其功能类似于致癌信号通路的必不可少的翻译和放大者, 正是Pin1将致癌信号和细胞增殖转化紧密联系［1］。
本实验应用反义核酸技术，成功构建了PIN1反义核酸的真核表达载体，利用阳离子脂质体介导将其转染MCF-7细胞并成功筛选出稳定表达Pin1反义核酸的MCF-7细胞亚克隆，观察细胞的增殖活性。我们在实验中发现，实验组比对照的细胞克隆延长到3.5周。实验结果显示，Pin1反义核酸可显著下调MCF-7细胞中Pin1的表达，明显抑制MCF-7细胞的增殖，表明Pin1基因过表达与乳腺癌细胞MCF-7的增殖失控可能密切相关。我们认为这是因为在乳腺上皮细胞发生转化和过度增殖过程中，丝/苏－脯氨酰磷酸化信号机制可能发挥重要作用，而磷酸化的丝/苏－脯氨酰基序可被Pin1特异性识别催化，而引起某些底物的构型和功能发生改变，致使信号分子不能及时降解，处于高度激活的持续状态，从而导致多种致癌信号持续放大，最终引起细胞转化和增殖失控。而Pin1反义核酸显著下调了MCF-7细胞中Pin1的表达，阻断Pin1功能，在肿瘤细胞中致癌信号不能产生级联放大作用，致癌通路被阻断，有助于恢复细胞内信号稳态，部分逆转恶性肿瘤细胞的过度增殖。
文献报道Pin1具有调节细胞周期运行的重要作用［11］，并通过参与调节P53、Bcl2功能发挥抗凋亡作用［12］。本实验通过转染技术观察Pin1基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长状态的影响，我们将进一步研究Pin1对乳腺癌MCF-7细胞周期及其抗凋亡作用并探讨其相关机制，为深入研究Pin1在乳腺癌中的作用奠定实验基础，并为乳腺癌基因研究和治疗提供新思路。
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作者单位：华中科技大学同济医院肿瘤生物医学中心，湖北 武汉 430030； 海南医学院附属医院妇产科，海南 海口 570105； 苏州大学附属第一医院妇产科，江苏 苏州 215007.