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【摘要】 目的 研究益妇宁软胶囊、莪术、哈蟆油对乳腺癌增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用，并探讨其凋亡的机理。方法 用益妇宁、莪术、哈蟆油作用于克隆化高转移人乳腺癌细胞（MCF-7），进行细胞增殖抑制实验、软琼脂集落形成试验，并通过DNA片断凝胶电泳法和TUNEL末端标记法检测细胞凋亡。结果 益妇宁软胶囊、莪术可明显降低细胞增殖能力并呈剂量依赖性，IC 50 为0.242μl/ml和0.201μl/ml，软琼脂集落形成率也显著降低（P<0.05和P<0.01）;上述浓度的药物处理48h均使MCF-7细胞凋亡率显著升高（P<0.01）且有剂量依赖性，哈蟆油在试验浓度范围内对MCF-7细胞抑制作用与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 益妇宁软胶囊、莪术具有抗人乳腺癌细胞（MCF-7）细胞增殖作用，并有诱导MCF-7细胞凋亡的作用。
关键词 人乳腺癌细胞 益妇宁 莪术 哈蟆油 凋亡
Study on effects of proliferation inhibition and apoptotic induction of Yifuning，Ezhu and oviductus Ranae in MCF-7cell
Zhang Dongfang，Wang Xiaohua，Ji Qiongmei，et al.
Department of Biochemistry Guangzhou Medical College，Guangzhou510182.
【Abstract】 Objective To investigate the induction of proliferate inhibition and apoptosis of human breast cancer cells（MCF-7）by traditional Chinese medicine ormula Yifuning soft capsules（YFN），Oviducts Curcumae（Ezhu），Oviductus Ranae（OR）in order to demonstrate the mechanism of their anticancer action.Methods The proˉliferation inhibitive rate the colony-formation rate in soft agar，were tested to observe the effects of YFN or Ezhu on MCF-7cells.TUNEL and DNA gel electrophoresis to demonstrate the apoptosis rate.Results Treated with YFN and Ezhu，the proliferation of MCF-7cells was inhibited obviously，and the inhibition degree was related to dose of the drug.IC 50 of the proliferation inhibition as0.242μl/ml and0.201μl/ml.Treated with0.115μl/ml and0.230μl/ml YFN or Ezhu，the colony-formation rate in semi-solid agar of the MCF-7cells were decreased significantly（P<0.05and P<0.01），the apoptosis rate of MCF-7cells were obviously after treatment with YFN or Ezhu in the above concentration and the inhibition were in a dose-dependent manner.OR It is no distinctly difference that OR inˉhibits the MCF-7cells in the range of testing concentration comparing with the contrast one.Conclusion YFN or Ezhu can inhibit the proliferation human breast cancer cells and induction of the cell apoptosis.Key words YFN Ezhu Oviductus Ranae apoptosis MCF-7cell
益妇宁是临床经验方剂，主要由莪术、哈蟆油组成。益妇宁软胶囊能从多个环节调节生殖内分泌功能，纠正激素水平波动或下降引起的植物神经系统功能紊乱，从而达到稳定体内环境，缓解更年期症状的作用 ［1］ 。益妇宁软胶囊主要成分哈蟆油（Oviductus Ranae）系蛙科动物中国林蛙雌性蛙的干燥输卵管，其另一主要成分莪术（Curcuma aro matica Salisb），含有多种抗癌有效成分，近年来的研究显示莪术是一种有效的抗肿瘤药物 ［2～4］ 。乳腺癌是妇女的主要恶性肿瘤之一，其发病率在我国和一些发达国家有上升的趋势。本实验以人乳腺癌细胞株（MCF-7）为材料，旨在研究和探讨益妇宁、莪术、哈蟆油对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。
1 材料
1.1 细胞株克隆化高转移人乳腺癌细胞（MCF-7）由广州医学院中心实验室冻存，该细胞可在裸鼠体内生长。
1.2 主要试剂 莪术是姜科植物广西莪术（Curcuma Kwangsiensis S.G..Lee et C.F.Liang）的干燥根茎，产地浙江省，由浙江省瑞安市制药厂提供，生药材由吉林省长春中医学院生药教研室姜大成教授鉴定;哈蟆油Oviductus Ranae（OR）系蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinesis David）雌性蛙的输卵管干燥制品，产地吉林省，由吉林省三宝堂有限公司提供YFN提取物由吉林省长春中医学院提供，质量标准:每克YFN提取物E 2 含量不低于40pg，莪术醇含量不低于40mg。RPMI-1640为Gibco公司产品;小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品;琼脂糖、蛋白酶K为宝泰克公司产品;Rnase A为NEC公司产品;胰蛋白酶为Fluka公司产品;其余试剂均为国产分析纯。TUNEL-POD试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品;PCRmarker购自华美生物工程公司。SM-3型酶标仪由北京圣健北方医疗仪器有限公司生产。
2 方法
2.1 细胞培养和药物处理 将乳腺癌（MCF-7）细胞接种于含10%小牛血清（pH7.4）的RPMI-1640培养液中，置37℃、5%CO 2 培养至指数生长期进行实验。MCF-7细胞分为对照组和实验组（实验组分别为益妇宁组、莪术组和哈蟆油组，下同）。益妇宁、莪术、哈蟆油分别稀释后去菌，经细胞毒性试验和增殖抑制试验确定药物浓度为0.230μl/ml。
2.2 益妇宁、莪术、哈蟆油对乳腺癌（MCF-7）细胞生长曲线的影响 取对数生长期的MCF-7细胞分为对照组和实验组（同2.1），接种于96孔培养板每孔加入细胞数为5×10 3 个，细胞贴壁生长后对照组分别加入终浓度为0.230μl/ml的益妇宁、莪术、哈蟆油，培养24、48、72、96、120h后分别用台盼蓝拒染法进行活细胞计数，每浓度平行3孔，取平均值，绘制细胞的生长曲线。
2.3 益妇宁、莪术、哈蟆油对MCF-7细胞增殖抑制的影响 取对数生长期的MCF-7细胞分为对照组和实验组（同2.1），接种于96孔培养板，每孔加入细胞数为6×10 3 个，实验组分别加入益妇宁、莪术和哈蟆油，各实验组加入终浓度分别为0.050μl/ml、0.100μl/ml、0.200μl/ml、0.400μl/ml、0.800μl/ml，培养96h，吸去上清后加MTT工作液（5g/L）10μl于各孔，继续孵育4h，弃去上清液，加200μl DMSO溶液所形成的蓝色甲，振摇10min使沉淀充分溶解，590nm波长测定每孔的吸光度A值。计算不同浓度的药物对MCF-7细胞的抑制率和相应的IC 50 。每组重复3孔，共做3批实验。IR%=（1-实验组平均A值 对照组平均A值）×100%
2.4 益妇宁、莪术对MCF-7细胞软琼脂集落形成的影响 经上述两种药物浓度均为0.115μl/ml和0.230μl/ml处理的MCF-7细胞72h后该细胞软琼脂集落形成，试验按细胞软琼脂集落形成常规方法进行，药物处理后的细胞在软琼脂中生长15天。
2.5 益妇宁、莪术诱导MCF-7细胞凋亡的作用 2.5.1 细胞凋亡测定 取对数生长期的MCF-7细胞分为对照组和实验组（实验组为益妇宁
组和莪术组）接种于6孔培养板，每孔加入细胞数为5×10 4 个，各实验组浓度均为0.115μl/ml和0.230μl/ml。TUNEL DNA片段末端标记法按武汉博士德生物工程公司TUNEL-POD试剂盒说明书并参考Sgonc等 ［5］ 的方法进行。倒置显微镜下观察形态学变化与对照组细胞比较统计凋亡率。
2.5.2 凋亡细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳 参照文献 ［6］ 并改进。取对数生长期的MCF-7细胞分为对照组和实验组（同2.5.1）每瓶2×10 5 个细胞，每组平行3瓶，待细胞贴壁后实验组分别加入0.230μl/ml益妇宁、莪术。对照组和实验组孵育60h、72h用于凋亡细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳试验。收集上清液及贴壁细胞后2000g离心15min，同组细胞合并，PBS清洗，重悬细胞于100μl裂解缓冲液（10mmol/L Tris-HCl pH7.4，含10mmol/L EDTA和0.5%Triton X-100）中，置4℃下20min，12000g离心30min。上清液中加入Rnase A后，37℃保温1h加入2mol/L NaCl20μl和异丙醇120μl，混合物置-20℃过夜。次日15000g离心20min，弃上清，加TE溶解。1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙啶） 电泳（100V，45min），紫外透射光观察。
2.6 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行f检验。
3 结果
3.1 益妇宁、莪术、哈蟆油对MCF-7细胞生长的影响 由细胞计数绘制的生长曲线可见，MCF-7细胞经0.230μl/ml益妇宁、莪术、哈蟆油处理后，益妇宁、莪术处理组细胞生长受到明显抑制（P<0.05），而哈蟆油处理组细胞生长未受到明显抑制（P>0.05），如图1所示。
图1 对照、益妇宁、莪术、哈蟆油处理MCF-7细胞的生长曲线（略）
3.2 益妇宁、莪术、哈蟆油对MCF-7细胞生长增殖的影响 与对照组比较益妇宁、莪术对MCF-7细胞生长有明显抑制作用（如表1所示），并具有剂量依赖关系。经直线回归法计算，其在96h的半数抑制浓度（IC 50 ）分别为0.242μl/ml、0.201μl/ml。哈蟆油对MCF-7细胞生长的抑制作用不明显（P>0.05）。
表1 益妇宁、莪术、哈蟆油对细胞增殖的抑制作用 （略）
3.2 益妇宁、莪术对PGCL3细胞软琼脂集落形成能力的影响 实验组分为益妇宁、莪术，各实验组浓度分别为0.115μl/ml和0.230μl/ml，经药物处理MCF-7细胞72h后，细胞软琼脂集落形成数均低于对照组（P<0.05和P<0.01），如表2所示。
表2 益妇宁、莪术对MCF-7细胞集落形成率的影响Group Dosage （略）
3.3 益妇宁、莪术诱导MCF-7细胞凋亡 TUNEL法测定细胞凋亡的结果如表3所示，可见益妇宁、莪术处理使MCF-7细胞凋亡率明显增加。
表3 益妇宁、莪术诱导MCF-7细胞凋亡率Group Dosage（略）
3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳分析 如图2所示，用浓度为0.230μl/ml的益妇宁、莪术作用MCF-7细胞72h，则未出现DNA ladder，而电泳图谱显示MCF-7细胞经益妇宁、莪术作用60h批次，经琼脂糖凝胶电泳分析DNA出现特征性的梯形条带，约180～200bp整数倍递增分布，提示DNA在核小体连接部位被切断，细胞发生凋亡，空白对照组则显示一分子量很大的条带，未见“阶梯状”带，显示对照组细胞基因组DNA完整，见图3、图4。（略）
4 讨论
本研究发现益妇宁、莪术既有抑制MCF-7细胞增殖作用，又有诱导凋亡作用，但益妇宁的另一主要成分哈蟆油 图4 MCF-7凋亡细胞细胞的增殖和凋亡则无明显影响。本研究结果显示益妇宁、莪术能明显抑制MCF-7人乳腺癌细胞增殖，其机理之一可能是诱导癌细胞恶性表型逆转，本研究证明益妇宁、莪术使MCF-7细胞软琼脂集落形成率显著下降，通常认为癌细胞在半固体琼脂上形成集落的多少与其恶性程度呈正相关。另一方面由于该药物有诱导MCF-7细胞凋亡而使其细胞数量减少。癌细胞增殖抑制可由多种机制导致，抗肿瘤药物杀死肿瘤细胞的分子机制，基本上通过诱导肿瘤细胞凋亡而起作用 ［7］ 本研究采用高灵敏度地反映细胞凋亡生化特征—DNA断裂的脱氧核苷酸转移酶末端标记法（TUNEL法）和DNA梯度断裂电泳法这两种方法测定凋亡细胞，证明益妇宁、莪术酸有诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用。一般认为细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸外翻是早期凋亡的特征，而DNA发生180～200bp及其倍数断裂是中、晚期凋亡的特征，此时DNA电泳图上呈现梯状条带，这是细胞凋亡最具特征的生化改变，是细胞凋亡时细胞内核酸内切酶被激活，将DNA链的核小体连接点切断所致。益妇宁、莪术作用MCF-7细胞60h组DNA电泳图上呈现梯状条带而72h组却不出现此现象，我们认为是断裂DNA片段已经降解的缘故。同时采用两种凋亡检测方法能更好地反映细胞凋亡的情况。细胞凋亡又称程序性死亡，是细胞主动参与的死亡过程，已证实细胞凋亡与肿瘤的发生和抑制有密切的关系。肿瘤细胞的凋亡亦是一个涉及多基因参与的过程，有研究证实 ［8，9］ p53，c-myc，Fas，bcl-2/bax等基因都参与了凋亡的发生。益妇宁、莪术诱导MCF-7细胞凋亡是否有靶向性调控基因的参与，我们将做进一步研究。王娟等 ［2］ 报道莪术能抑制人肝癌细胞株SMMC-7721生长，王等 ［3］ 和王汉平等 ［4］ 先后报道莪术有诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用和抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡。近年来一些研究显示莪术是一种有效的抗肿瘤药物且对癌细胞增殖的抑制作用可能具有普遍意义。益妇宁是临床验方，试验已证实该药能从多个环节调节生殖内分泌功能，纠正激素水平波或下降引起的植物神经系统功能紊乱，从而达到稳定体内环境，缓解更年期症状的作用 ［1］ 。莪术含有多种抗癌有效成分，它是益妇宁软胶囊主要成分，因此，益妇宁不仅有调节女性更年期内分泌的作用，还有抗妇女的主要恶性肿瘤之一乳腺癌的作用，因而益妇宁软胶囊具有较好的临床应用前景。
参考文献
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（收稿日期:2004-05-26） 作者单位:1510182广东广州广州医学院生物化学与分子生物学教研室2510515广东广州第一军医大学中医系
（编辑维 兰）