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Zhang Yubao，Ma Yuyan，Wang Bo，et al.
The surgical department of the tumor hospital of harbin medical university，150040.
【Abstract】 Objective The aim of this study is to discuss whether the Jinke plaster can reverse the MDR of the breast cancer cell strian MCF-7/A to ADM or not and the mechanism.Methods MTT method was used to deˉtect the cell toxicity，drug-resistant multiple and reversing multiple;Fluorospectorphotometer was used to detect the concentration of ADM in cell;Fluoro-quantitative PCR method was used to detect the effect of the drug on the exˉpressing level of MDR-1mRNA in cell.Results （1）0.01mg/ml H uaierkeli plaster can significantly reduce the IC 50 （3.95μg/ml）of ADM to the drug resistant cell strain（MCF-7/A）of breast cancer.It has significant difference comparing to the IC 50 （17.67μg/ml）the drug-resistant cell strain MCF-7/A without reverseing（P<0.05），its reˉversing multiple is4.5times，its drug-resistant multiple is21.7times.（2）0.01mg/ml Huaierkeli plaster can signifiˉcantly increase the concentration of ADM in drug-resistant cell，the result has significant difference.（P<0.01）.（3）MDR-1mRNA does not express in the sensitive cell strain MCF-7/A of human breast cancer，the huaierqing with lower toxicity or without toxicity make the expressing level of MDR-1of MCR-7/S and there is significant difˉference（P<0.01）.Conclusion This research indicate thast Jinke-huaierkeli plaster can reverse the drug-resisˉtance of MCR-7/A，and its mechanism is that it can make the expressing level of the drug resistant gene-MDR-1lower.At the same time this research initially indicate that Jinke plaster has two effects，one is the activity of anti-tuˉmor.the other is reverse thd drug-resistance.
Key words breast cancer MDR MCF-7/A Jinke reverse activity
乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐渐增加的趋势，是引起妇女死亡的重要肿瘤之一。多药耐药现象（MDR）是乳腺癌临床化疗失败的主要原因，克服MDR是目前肿瘤防治研究的热点。目前已发现的许多逆转多药耐药的药物，由于疗效不理想，毒副作用大，在临床上很难推广应用。金克-槐耳颗粒为国家中药一类新药，具有化疗药的功效，良好的凋亡效果和免疫增强调节功能，能促进肺癌耐药的细胞株耐药性发生逆转，无毒副作用，本实验旨在验证金克在无毒剂量时能否增强乳腺癌多药耐药组包株MCF-7/A对阿霉素的敏感性，并探讨了逆转机制，以期待能找到逆转MDR效果好并且无毒副作用的逆转药物，发挥中药在肿瘤治疗中作用，进一步增强乳腺癌的化疗效果，提高生存率。
1 材料与方法
1.1 设备及主要试剂 金克-槐耳颗料是由江苏启东盖天力制药有限公司提供;MTT为Sigma产品;ADM为意大利Farmitalia公司产品;二甲基亚砜（DMSO）分析纯为天津市大茂化学仪器供应站提供;MDR 1 荧光定量RT-PCR诊断试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司提供;RPMI-1640为美国Gibco BRL公司产品，胎牛血清购自中国医学科学院血液研究所。塑料培养瓶和培养板均为美国Costar公司产品，酶标仪为BioRAD公司产品450型，荧光分光光度计RF-510型为日本岛津产品，荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
1.2 细胞株及细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7/S及相应的耐阿霉素细胞株MCF-7/A均由中国医学科学院天津血液研究所提供。在37℃、体积分数为5%的CO 2 饱和湿度培养箱中，分别培养于含10%血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，3天传代一次。MCF-7/A细胞除上述培养条件外，需加入1.0μg/ml的ADM，以维持细胞的耐药性。
1.3 细胞毒性实验 用胰酶消化细胞后，调整敏感株和已经停加ADM2周的耐药株细胞浓度为2×10 5 /ml，每孔100μl接种于96孔板中。实验设计3组，每组均设3个平行孔，实验组为槐耳颗粒组和ADM组，对照组为未加药的空白对照，实验组两组均分别从第1孔到第12孔倍比稀释，每孔所加的药物最终为100μl。将96孔板置于37℃5%CO 2 孵箱中，培养48h后，每孔加入MTT液20μl，继续培养4h后，去掉上清液，每孔加入二甲基亚枫（DMSO）100μl，用振荡器震荡5min，室温放置数分钟，待紫色颗粒完全溶解后，用全自动酶标仪测定每孔的A490nm值，取3个平行孔的平均值，按公式计算细胞抑制率（IR）:IR（细胞抑制率）=［1-实验组A均值/对照组A均值］×100%，并求出IC 50 值（半数细胞抑制剂量）及耐药倍数（耐药细胞IC 50 /敏感细胞IC 50 ）。选择细胞抑制率<15%的药物浓度为该药的低毒剂量，选择细胞抑制率<5%的药物浓度为该药的无毒剂量。
1.4 MTT法测定耐药细胞对ADM的敏感性 实验方法同前，只是细胞均为耐药细胞。实验设计分为3组:（1）倍比稀释ADM组;（2）无毒剂量槐耳颗粒+倍比稀释ADM组;（3）未加药的空白对照组。计算每组的IC 50 值，求出逆转倍数（未加逆转剂组的IC 50 /加逆转剂组的IC 50 ）。
1.5 荧光分光光度计测定细胞包内ADM药物浓度 细胞处理同前，取对数生长期耐药细胞2×10 5 /ml。实验分2组:实验组无毒剂量槐耳颗粒5.0ml+不同浓度的ADM（100，50，10μg/ml）;对照组只加ADM（100，50，10μg/ml）。含10%胎牛血清的1640培养液5ml，混匀置孵箱中培养，将ADM及槐耳颗粒按要求加入培养3h。收集细胞，离心用PBS洗3次，重新悬浮于0.3mol/L HCl的50%乙醇消化液中消化过液（4℃），离心沉淀，据ADM本身发荧光的特点，取上清液于荧光分光光度计上测定荧光强度（激发波长E x λ=470nm，发射波长E x λ=585nm，狭缝宽10nm）每个样品做3个平行管，同时做ADM浓度-荧光强度标准曲线。
1.6 荧光定量PCR法测定MDR 1 基因表达水平 细胞培养同前，实验分4组:（1）敏感细胞MCF-7/S组;（2）耐药细胞MCF-7/A组;（3）耐药细胞MCF-7/A+槐耳颗粒1.0mg/ml组;（4）耐药细胞MCF-7/A+槐耳颗粒0.01mg/ml组。继续培养10h后，用PBS洗3次，-80℃冻存，按荧光定量RT-PCR试剂盒说明的条件操作，测定各组MDF-1基因表达水平。
1.7 统计学方法 全部资料用SPSS10.0软件进行统计分析，计量资料用ˉx±s表示，各组及组间比较用t或χ 2 检验。
2 结果
2.1 金克-槐耳颗粒对MCF-7/S和MCF-7/A生长的影 响 根据酶标仪输出结果，槐耳颗粒在1.0mg/ml时，对MCF-7/S和MCF-7/A均没有明显的抑制作用，细胞存活率>85%，为低毒剂量。槐耳颗粒在0.01mg/ml时，细胞存活率>95%，我们采用0.01mg/ml槐耳颗粒作为非细胞毒性剂量。槐耳颗粒对敏感细胞MCF-7/S和耐药细胞MCF-7/A的IC 50 分别为9.78μg/ml和10.38μg/ml，差异无显著性（P>0.05），说明MCF-7/A细胞对金克-槐耳颗粒不具耐药性。
2.2 0.01mg/ml的金克-槐耳颗粒对MCF-7/A细胞MDR的逆转作用 MCF-7/A对ADM显示耐药性，其IC 50 为17.669μg/ml，而MCF-7/S对ADM敏感其IC 50 为0.8155μg/ml。耐药细胞MCF-7/A较敏感MCF-7/S细胞对ADM耐药倍数为21.7倍（17.669μg/ml/0.8155μg/ml）。经0.01mg/ml的槐耳颗粒与ADM联合作用后，耐药细胞MCF-7/A对各组ADM的敏感性增强，其IC 50 明显下降，为3.95μg/ml，其逆转倍数为4.5倍（17.669μg/ml/3.95μg/ml）。
2.3 荧光分光光度计测定细胞包内ADM药物浓度结果 实验组和对照组的荧光强度测定后，分别在ADM浓度-荧光强度标准曲线上确定相应的细胞内化疗药物ADM浓度，具体结果见表1。从表1可以看出，实验组与对照组MCF-7/A细胞内药物浓度随着ADM实验浓度的增加而增加，但是，实验组细胞内ADM浓度增加多于对照组，经统计学处理差异有显著性（P<0.05）。说明槐耳颗粒0.01mg/ml对MCF-7/A细胞内ADM浓度有积累的作用。
表1 0.01mg/ml槐耳颗粒对MCF-7/A 细胞内ADM浓度的影响 （略）
注:与对照组比较， ˇ P<0.05
2.4 荧光定量PCR仪测定MCF-7/A细胞MDR 1 mRNA表达水平的变化 采用荧光定量PCR法测定MCF-7/S细胞无MDR 1 mRNA表达。MCF-7/A有MDR 1 mRNA表达并且呈高值作为对照组。不同浓度槐耳颗粒组与对照组相比MDR 1 mRNA表达水平下调，且经方差分析与对照组差异有非常显著性（P<0.01）。详见表2。
表2 槐耳颗粒对MCF-7/A细胞MDR 1 mRNA 表达水平的影响 （略）
注:与对照组比较， ˇ P<0.01（MCF-7/A+1.0为耐药细胞MCF-7/A加槐耳颗粒1.0mg/ml组，MCF-7/A+0.01为耐药细胞为MCF-7/A加槐耳颗粒0.01mg/ml组
3 讨论
恶性肿瘤在临床化疗过程中产生多药耐药性（MDR），是化疗失败的主要原因。因而应用MDR逆转剂是克服肿瘤细胞耐药，提高化疗效果的一种重要手段。MDR ［1］ 是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不但对该药产生了耐药性，而且对那些从来未接触过的结构、功能及杀伤机制完全不同的其它化疗药物也产生了耐药。化疗药物耐药在乳腺癌中普遍存在 ［2］ ，其多药耐药基因MDR 1 表达水平与肿瘤大小、病理组织学分化程度及ER情况均有密切关系。引起耐药的原因机制很多，目前研究最多的是多药耐药基因（MDR 1 ）及其编码的细胞膜P-糖蛋白药（P-gp）表达增加。所以，寻找有效的具有临床应用价值的逆转剂，是提高肿瘤化疗效果的关键。
自从Tsumo等 ［3］ 首次报告维拉帕米（VRP）能逆转P388/VCR细胞对长春新碱（VCR）的耐药性以来，MDR逆转剂发展非常迅速。第一代逆转剂如环孢素A、维拉帕米，其逆转MDR的活性较低，并且有较严重的毒副作用。第二代逆转剂与第一代结构类似，且具有较高的选择性和较低毒性，如右旋维拉帕米、环孢素A衍生物。第三代逆转剂则是专门为逆转MDR而设计开发的化合物，具较强而且稳定的逆转MDR活性。从中草药中寻求有效成份，来逆转MDR是目前研究的热点 ［4］ 。槐耳是生长在中国槐上的药用真菌，槐耳颗粒是从槐耳菌质中提取的多种有效成份，其主要活性成份是多糖蛋白（PS-T）。目前已有其成品（金克-槐耳颗粒，国家一类新药）运用于临床，对肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌均有独特疗效。本项研究证明，槐耳颗粒在无细胞毒性剂量0.01mg/ml时能增强ADM对MCF-7/A细胞的毒性作用，其逆转倍数为4.5倍，与对照组相比，明显增加了细胞内ADM浓度，显著提高了耐药细胞MCF-7/A对ADM的化疗敏感性。
MCF-7/A细胞是多药耐药基因MDR扩增，过度表达P-gp蛋白的耐药性细胞，抗癌药物被P-pg蛋白排出细胞外，使细胞内抗癌药物浓度下降是其产生MDR的主要原因。测定细胞内ADM的药物浓度情况能反映出药物对P-gp蛋白功能的影响状况。实验表明小剂量槐耳颗粒与 ADM合用4h后，能明显增加了MCF-7/A细胞内药物浓度。说明槐耳颗粒能抑制P-gp蛋白的功能，而减少药物的外排。本实验通过荧光定量PCR法进一步证明，小剂量槐耳颗粒能使耐药细胞MDR 1 mRNA水平表达下调，进一步证明抑制P-pg的功能及其表达而提高细胞内药物浓度是槐耳颗粒逆转MDR的主要机制。李文瑜等 ［5］ 将白血病多药耐药细胞系K 562 /A 02 细胞与苦参碱联合应用时，发现苦参碱可下调K 562 /A 02 细胞MDR 1 mRNA表达，与对照组差异有显著性（P<0.01），这与本实验结果一致。潘启超等 ［6］ 对十几种中草药单体做了体外实验，发现粉防己碱（TTD）和蝙蝠葛碱（DRC）能明显增加阿霉素对MCF-7/A细胞毒性，并能增加ADM在MCF-7/A细胞内的积累，而对敏感的MCF-7/S细胞没有影响，且毒性较低，这说明中药有效活性成份在克服MDR方面将发挥很大作用。
综上所述，槐耳颗粒具有双效性，不仅是一种抗肿瘤药物，又是一种耐药逆转剂。因此，在联合化疗中，槐耳颗粒本身可发挥抗肿瘤作用，同时又可以作为逆转剂，提高化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用，能有效提高化疗效果，且金克-槐耳清膏无任何毒副作用，可以广泛临床应用。
参考文献
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3 胡振，张惠斌，黄文龙，等.肿瘤多药耐药逆转剂的研究进展.药学进展，2002，26:129-133.
4 蔡天革，唐风德，殷忠东，等.中药逆转化疗多耐药性（MDR）研究概述.中药新药与临床药理，2002，13:129-131.
5 潘启超，田晖.多种中药单体逆转肿瘤多药耐药性.科学通报，1995，40:1901-1904.
6 李文瑜，李舜华，崔克义，等.苦参碱逆转的白血病多药耐药细胞系K 562 /A 02 对柔红霉素耐药性的研究.中国病理生理学杂志，1998，14:521-523.
作者单位:150040哈尔滨医科大学附属肿瘤医院外科（ Δ 通讯作者）
哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所