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【摘要】 目的 观察不同浓度的视黄酸（retinoid acid,RA)对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响。方法 以不同浓度RA（10-10～10-6mol/L）处理细胞，采用活细胞计数法观察细胞增殖情况，用氨基安替比林法测定碱性磷酸酶（AKP）活性；通过流式细胞仪技术，测定RA作用后其细胞周期分布。结果 RA对MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用，10-7mol/L RA作用5天后活细胞计数为对照组的60%，细胞在G0/G1期停滞；RA还可使MCF-7细胞AKP活性增高，这种作用具有时间和剂量依赖性。结论 RA对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用，细胞在G0/G1期停滞。
【关键词】 视黄酸；碱性磷酸酶；细胞周期；乳腺肿瘤
Effects of RA on proliferation and cell cycle of MCF-7 in vitro
HUI Ning,XU Ming-juan,LIU An,et al.Department of Obstetrics and Gynecology,Changhai Hospital,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China
【Abstract】 Objective To study the effects of RA(Retinoid Acid),a synthetic RA,on the cell proliferation and cell cycle of a human breast carcinoma cells.Methods After treated with different concentration of RA(10-10～10-6mol/L),alkaline phosphatase(AKP) activity was determined.The cell cycle progression was examined with flow cytometry.Results RA inhibited the proliferation of MCF-7 cells,the cell number was 60% compared with the control after the treatment with RA(10-7mol/L) for 5 days.AKP activity craised significantly after treatment with RA(10-6mol/L)for 1～5days.Dose-response studies revealed that the AKP activity of MCF-7 cells increased progressively as a function of RA concentrations.Conclusion Glucocortocoids play an important role in the regulation of MCF-7 cell proliferation and differentiation,inducing G0/G1 arrest.
【Key words】 retinoid acid;alkaline phosphatase;cell cycle;breast neoplasms
乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，临床流行病学及内分泌治疗的良好效果均提示雌激素与乳腺癌的关系密切，为激素相关性肿瘤。视黄酸为维生素A的衍生物，对许多细胞的生长及分化都有调节作用，对许多组织来源的肿瘤细胞均有增殖抑制作用和诱导分化作用［1～3］，在胚胎发育和形态发生过程中也有重要调节作用。本文旨在探讨视黄酸对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响，为进一步阐明其作用机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 生化试剂及其配制 药物和试剂：RA为Sigma产品，用无水乙醇配成为10-7～10-3mol/L，置-20℃备用。柠檬酸三钠，2H2O，RNAase，碘化丙啶，生色反应试剂盒，考马斯亮蓝G250溶液，均为Sigma产品。
1.2 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7含雌激素受体及孕激素受体，由上海中国科学院细胞生物所细胞库提供，常规培养于含10%小牛血清和抗生素的DMEM培养基中（5%CO2），每周传代1～2次。取对数生长期细胞置于24孔板中培养，细胞初浓度为2×104细胞/（孔·ml），24h后去除培养液，每孔中加入含有不同浓度RA的新鲜培养液，终浓度分别为10-10～10-6mol/L，对照组细胞加入等体积无水乙醇，终浓度为0.1%。细胞继续培养一定时间后，去除培养液，胰蛋白酶消化后用台盼蓝拒染法行活细胞计数。
1.3 碱性磷酸酶（AKP）活性测定 AKP活性测定参见文献［4］，并表示为nmol/(min·mg),蛋白浓度用Bradford法测定［5］。
1.4 流式细胞仪测定细胞周期 调整细胞浓度为3×104/ml，接种于培养瓶中，用含15%小牛血清的DMEM培养基培养24h后，换成含2%小牛血清的培养基，饥饿24h以达到同步化，然后加入含5%小牛血清和10-7M RA的DMEM。培养一段时间（12、24、48、72h）后收集细胞。将（2×105～1×106）/ml细胞，75%乙醇固定24h，柠檬酸固定1h，RNA酶消化，加碘化丙啶染色4℃避光静置15min，流式细胞仪进行分析［6］。
1.5 统计学方法 每组试验重复3次以上，采用方差分析和t检验。
2 结果
2.1 视黄酸对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响 在悬浮培养体系中，视黄酸对MCF-7细胞的增殖具有抑制作用。不同浓度的RA作用MCF-7细胞5天，10-9～10-6mol/L RA对细胞生长有明显的抑制作用（图1）。
注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01
图1 视黄酸对MCF-7细胞增殖的影响 （略）
2.2 RA对AKP活性的影响 不同浓度的RA（10-10～10-6mol/L）作用MCF-7细胞48h后，除10-10mol/L RA组，AKP活性均明显升高（P<0.01),其中10-7mol/L RA组AKP活性为对照组的4倍，且具有明显的剂量依赖性特点（图2）。用10-7mol/L RA处理MCF-7细胞1～5天后，AKP活性随着作用时间增加较对照组明显升高，具有时间依赖性特点（图3）。
注：与对照组比较，**P<0.01
图2－图3 （略）
2.3 RA对MCF-7细胞周期分布的影响 以RA（10-7M）分别处理细胞24、48和72h，做流式细胞仪分析。结果如表1所示，RA处理后可引起G0/G1期细胞比率明显增加，同时，S期细胞比率减少，且这种作用随处理时间延长而更趋明显，而G2/M期无明显变化。
表1 RA对MCF-7细胞细胞周期分布的影响 (略）
3 讨论
本部分工作表明，视黄酸对MCF-7细胞具有增殖抑制的作用，其作用不是由于激素的非特异性毒性作用引起，因为在激素作用过程中细胞存活率没有降低。视黄酸（10-7mol/L RA）作用MCF-7细胞120h后，10-7M RA组细胞数为对照组的60%；细胞系碱性磷酸酶表达明显增加，MCF-7细胞碱性磷酸酶活性增加为对照组的4倍；与Heusden［7］、Tsai等［8］报道一致。本试验通过流式细胞仪分析发现，RA能够阻止MCF-7细胞的细胞周期进展，表现为诱导G0/G1期停滞，与Zhu［9］、Manfiarotti等［10］结果一致。
甾体激素主要通过受体发挥作用。视黄酸受体和雌激素受体、糖皮质激素受体同属于甾体激素受体超家族，这些受体发挥作用的方式是类似的。激素与受体结合后，经过或不经过转位，在核内以同源或异源二聚体的形式与靶基因启动子附近各自的激素反应元件结合，在基础转录器以及共作用因子的参与下，调节靶基因的表达，最终引起各种相应的生物学效应［11，12］。在乳腺癌细胞MCF-7中是否存在视黄酸受体，视黄酸抑制细胞增殖的作用是否通过视黄酸受体来介导，有待进一步研究。
【参考文献】
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9 Zhu WY,Jones CS,Kiss A,et al.Retinoic acid inhibition of cell cycle progression in MCF-7 human breast cancer cells.Experimental cell research,1997,234:293-299.
10 Manfiarotti R,Danova M,Alberici R,et al.All-trans retinoic acid(ATRA)-induced apoptosis is preceded by G1 arrest in human MCF-7 breast cancer cells.British J of Cancer,1998,77(2):186-191.
11 Hu X,Zuckerman KS.Transforming growth factor:signal transduction pathways,cell cycles mediation and effects on hematopoiesis.J Hemotother Stem Cell Res,2001,10:67-74.
12 McEwan IJ,Wright APH,Gustafsson JA.Mechanism of gene expression by the glucocorticolid receptor:role of protein-protein interactions.Bioessays,1997,19:153-160.
作者单位： 200433 上海，第二军医大学长海医院妇产科
(编辑：魏 冉)