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【摘要】 目的 考察高效液相色谱法（HPLC） 测定乙酰半胱氨酸颗粒中有关物质的适用性。 方法 采用Kromasil C18色谱柱，规格为4.6×250mm,粒度为5μ，以甲醇—缓冲液 （21:215）,调节pH至1.40为流动相，流速为1ml·min-1,检测波长205nm，柱温25℃。 结果 乙酰半胱氨酸峰与各辅料、已知杂质及其它降解杂质峰达到有效分离。 结论 选择条件显示HPLC法具有灵敏、准确、重现性好，可有效测定乙酰半胱氨酸颗粒中有关物质。
【关键词】 高效液相色谱法；乙酰半胱氨酸颗粒；有关物质
Detection of relevant substance from acetylcysteine granules by HPLC.
WANG Fang-xia, XU Chuang-li, CHEN Zan-min.
（Hainan Provincial Institute for Drug Control, Haikou 570216, Hainan, P. R. China）
Abstract：Objective To review the applicability of determination of relevant substances in acetylcysteine granules by HPLC method. Methods A HPLC method with UV detection was employed．The chromatographic conditions used were: Kromasil C18 column（4.6mm×250mm,5μm）,a flow rate of 1ml·min-1 for the mobile phase with a pH of 1.40 of methanol/buffer solution （21:215）,an isocratic elution mode carried out at column temperature（25℃）,and the UV detection at a wavelength of 205nm. Results The resolution between the acetylcysteine peak and exicipients,known impurities, unknown impurities were not less than 1.5. Conclusion It is an accurate and sensitive method for the determination of the relevant substances in acetylcysteine granules.
Key words：HPLC； Acetylcysteine granules；Relevant substances
乙酰半胱氨酸为合成谷胱甘肽的必需氨基酸，是一种含有巯基的抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎，保护肝脏、肺、心脏和神经细胞等作用，用于治疗急性、慢性支气管炎以及其他原因引起的粘痰合并发生的肺部疾病。乙酰半胱氨酸作为粘痰溶解药已收载于我国药典［1］。用作治疗急性、慢性支气管用药中的祛痰剂，已证明口服中等剂量（0.2～0.6g/d）具有肯定疗效。口服乙酰半胱氨酸有止咳祛痰的作用［２］,对急性肺损伤有防治作用［３］，对急性心肌梗塞溶栓治疗有抗氧化作用［４］。国内上市的剂型有喷雾乙酰半胱氨酸、胶囊剂、片剂、颗粒剂等。“乙酰半胱氨酸颗粒”原执行的质量标准为国家药品标准新药转正标准第42册。国家食品药品监督管理局对原标准进行修订,修订后的国家药品标准号为WS1-（X-261）-2003Z -2006）［５］，并于2007年1月27日开始执行。与原国家标准比较，增订了有关物质检查、修订了含量测定项。为验证增订的“有关物质”检查方法对海南某制药有限公司生产的“乙酰半胱氨酸颗粒”的适用性，现对有关物质进行方法学验证。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 安捷伦1100系列的高效液相色谱仪；色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，填料为Kromasil,产品号为4C18254F，规格为4.6×250mm,粒度为5μ，Hanbon science &.Technology Co.,Ltd生产。乙酰半胱氨酸颗粒剂（批号：061210、061211、061212，海南某制药有限公司生产）；乙酰半胱氨酸对照品（批号：140671-200501，中国药品生物制品检定所提供）；乙酰半胱氨酸原料（批号：0260064265，海南某制药有限公司提供）；L-Cystine 已知杂质（批号：N.ST000000772，含量：99.0%，海南某制药有限公司提供）；Cysteine Hydrochloride Hydrate已知杂质（批号N.ST000000773，含量：99.9%，干燥失重：10.3%，海南某制药有限公司提供）；N,S-Diacetylcysteine已知杂质（批号N.ST000200467，含量：99.6%，干燥失重：0.07%，海南某制药有限公司提供）；N,N’-Diacytylcysteine已知杂质（批号：5，含量：90.9%，海南某制药有限公司提供）；蔗糖、橙汁颗粒、橙味香精、糖精、日落黄等辅料（均由海南某制药有限公司提供）。
1.2 方法 按HPLC方法，对方法中的各色谱条件，测试波长和稳定性进行考察。
2 结果
2.1 色谱条件 采用十八烷基键合硅胶为填充剂，检测波长为205nm；流速为1.0ml/min；进样量10μl。调节不同的流动相，对杂质、辅料进行分离度试验。
2.1.1 调节流动相成分比例 以甲醇-缓冲溶液（硫酸铵2.25g、庚烷磺酸钠1.82g，加水溶解并稀释至450ml，用7mol/L盐酸溶液调pH至2.0）（8.8:91.2）为流动相，按国家药品标准号为WS1-（X-261）-2003Z -2006）进行测定， 其分离度色谱图见图1。
2.1.2 调节流动相pH值 以甲醇-缓冲溶液（硫酸铵2.25g、庚烷磺酸钠1.82g，加水溶解并稀释至450ml，用7mol/L盐酸溶液调pH至2.0）（21:215），混合后用7mol/L盐酸溶液调节pH至1.4 为流动相，按现行国家药品标准（标准号为WS1-（X-261）-2003Z -2006）进行测定， 其分离度色谱图见图2。
图1 pH2.0分离度色谱图（略）
1. 蔗糖；2. 橙汁颗粒；3. 主峰与日落黄；4. 糖精；5. N,N’-二乙 酰胱氨酸；6. 半胱氨酸；7. N,S-二乙酰半胱氨酸；8. 胱氨酸
图2 pH1.4分离度色谱图（略）
1. 蔗糖；2. 橙汁颗粒；3. 主峰；4. 日落黄；5. N,N’-二乙酰胱氨酸；6. N,S-二乙酰半胱氨酸；7. 半胱氨酸；8.糖精；9. 胱氨酸
2.2 检测波长选择 取乙酰半胱氨酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解制成10μg/ml的溶液，照分光光度法（中国药典2005年版二部附录Ⅳ A），在400～200nm的波长范围内扫描。试验结果表明，本品在205nm波长处仅有末端吸收。
2.3 专属性试验
2.3.1 酸破坏试验 取乙酰半胱氨酸原料适量（批号：0260064265），精密称定，加1mol/ml的盐酸溶液1ml，室温放置24h，加1mol/ml的氢氧化钠溶液1ml，以流动相稀释制成1mg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4，结果见图3。
2.3.2 碱破坏试验 取乙酰半胱氨酸原料适量（批号：0260064265），精密称定，加1mol/ml的氢氧化钠溶液1ml，室温放置24h，加1mol/ml的盐酸溶液1ml，以流动相稀释制成1mg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4，结果见图4。
2.3.3 高温破坏试验 取乙酰半胱氨酸原料适量（批号：0260064265），于105℃加热2h，放置至室温，精密称定，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，调节流动相pH值为1.4，结果见图5。
2.3.4 氧化破坏试验 取乙酰半胱氨酸原料适量（批号：0260064265），精密称定，加30％双氧水1ml，室温放置24h，以流动相稀释制成1mg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，调节流动相pH值为1.4，结果见图5。
2.3.5 光照破坏试验 取乙酰半胱氨酸原料适量（批号：0260064265）于紫外光下光照2d，精密称定，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4，结果见图7。
2.3.6 辅料干扰试验 取混合后的辅料适量，加流动相制成一定浓度的溶液（按处方比例配制），按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4，结果见图8。
2.3.7 取精密度试验项下第一份供试液，按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4，结果见图9～10。
图3 酸破坏色谱图（略）
图4 碱破坏色谱图（略）
图5 高温破坏色谱图（略）
图6 氧化破坏色谱图（略）
图7 光破坏色谱图（略）
图8 空白辅料（略）
图9 未破坏供试液（略）
图10 空白溶剂（略）
2.3.8 已知杂质试验 参照进口药品注册标准JX20010094取N,N’-二乙酰胱氨酸、半胱氨酸、N,S-二乙酰半胱氨酸、胱氨酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成40μg/ml的溶液，按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4。当流动相pH值为2.07时，日落黄辅料色谱峰与主峰未能有效分离，结果见图1；当流动相pH值为1.40时，主峰与各辅料及已知杂质峰达到有效分离，结果见图2。
2.3.9 最低检测限 取中检所乙酰半胱氨酸对照品约25mg，加流动相稀释并制成0.16μg/ml的对照品溶液，进样量为5μl，同法测定，结果最小检出量为0.8ng。
2.4 精密度试验 取乙酰半胱氨酸原料（批号：0260064265），精密称定，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另精密量取该溶液，以流动相为溶剂制成10μg/ml的溶液，作为对照溶液。按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4。由精密度试验结果表明，单个杂质的均值为0.05%，总杂质的均值为0.06%，RSD分别为12%和26%（n=9）。
2.5 稳定性试验 取乙酰半胱氨酸原料（批号：0260064265），精密称定，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；供试品溶液分别置0、1、2、3、4、6、8、12h按现行国家药品标准测定，仅调节流动相pH值为1.4。在各个时间段，最大杂质和总杂质分别为0.05%，0.08%，0.07%，0.09%，0.09%，0.10%和0.09%，均值和RSD也皆为0.08%和18.98%。提示本品溶液在12h内基本稳定。
2.6 样品测定 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另精密量取该溶液，以流动相为溶剂制成10μg/ml的溶液，作为对照溶液。按现行国家药品标准（标准号为WS1-（X-261）-2003Z-2006）进行测定，结果见表1。
表1 硐供试样品稳定性试验（略）
3 讨论
3.1 本法测定的成分多，要求的色谱条件较高，建议采用本法采用的色谱柱，即色谱柱为十八烷基键合硅胶柱，填料为Kromasil,产品号为4C18254F，规格为4.6×250mm,粒度为5μ，Hanbon science &.Technology Co.,Ltd生产,以便结果易于重现。
3.2 中国药典2005年版附录高效液相色谱法的流动相组份不得改变，其比例可以进行调节，未规定可以改变pH值。经过方法学验证，仅改变流动相比例无法使杂质达到有效的分离，流动相的pH值对分离度影响较大，建议检验过程中，适当微调流动相的pH值。
3.3 辅料和已知杂质干扰试验中，乙酰半胱氨酸对照品、蔗糖、橙汁颗粒、日落黄、糖精辅料和N，N’-二乙酰胱氨酸、N，S’-二乙酰半胱氨酸、半胱氨酸及胱氨酸已知杂质色谱峰的保留时间分别约为5.5、2.6、3.9、6.9、14.3、8.2、10.3、11.6和24.0min，乙酰半胱氨酸峰和各辅料及已知杂质峰的保留时间不重合。本色谱条件完全符合检验要求。
3.4 本测定方法能使乙酰半胱氨酸峰与各辅料、已知杂质及其它降解杂质峰达到有效分离。虽然质量标准中未规定扣除辅料峰，但国家药典会“关于国家有关内容执行问题的函（国药典化发［2007］8号文）已明确国家规定有关物质检查杂质计算的应扣除辅料峰后计算，因此本法能有效测定该公司生产的“乙酰半胱氨酸颗粒”中有关物质的含量。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典2005年版二部［M］.北京：化学工业出版社,2005.
［2］ 李长生，杨炯，李清泉，等. 乙酰半胱氨酸胶囊止咳祛痰作用的临床研究［J］.中国医院药学杂志，1999,19（11）:676.
［3］ 朱运奎，张世范，胡振萍，等. 精氨酸和乙酰半胱氨酸对油酸致急性肺损伤防治作用的实验观察［J］.兰州医学院学报,1996,22（2）:7.
［4］ 杨杰孚，Irene S,MargaretA A等.乙酰半胱氨酸在急性心肌梗塞溶栓治疗中的抗氧化作用［J］.中华心血管病杂志,1996,24（4）:282.
［5］ 国家药典委员会.国家药品标准［S］.WS1-（X-261）-2003Z-2006.
作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216.