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【摘要】 目的 探讨二期梅毒患者外周辅助性T淋巴细胞（Th）亚群的分化取向及其在梅毒发病机制中的作用。 方法 采用流式细胞术检测经三色荧光抗体染色的二期梅毒患者外周血CD4+/IFN-γ+（Th1）、CD4+1/IL-4+（Th2）、CD4+/IFN-γ+/IL-4+（Tho）细胞含量。结果 梅毒组Th1细胞含量、Th1/Th2比值均明显低于正常对照组（P<0.05），梅毒组存在Th1细胞分化偏态性。结论 二期梅毒患者Th细胞亚群分化失衡，可能是机体不能完全清除T.p,造成T.p潜伏体内形成长期感染的关键因素。
【关键词】 梅毒;流式细胞术;Th细胞亚群；偏态分析
Detection of peripheral blood Th and Tc lymphocyte sulsets in patients with secondary syphilis and its clinical significance.
ZOU Xun-hui, FAN Yi-ming, WU Zhi-hua.
1.Huizhou Hospital of Dermatology,Huizhou 516008, Guangdong, P. R. China.
2. Department of Derrnatology Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong, P. R. China.
Abstract：Objective To investigate the differentiation direction of Th cells in peripheral blood of the patients with secondary syphilis. Methods A three-colour immunoflurescent antibody was used to stain the peripheral blood T cells in observation group and the centrols and the concentrations of CD4+/IFNγ+ (Th1)、CD4+1/IL-4+ (Th2)、CD4+/IFNγ+/IL-4+ (Tho) cells in peripheral blood in both groups were detected by flow cytometry. Results Compared to controls, the number of Th1 cells in patients with secondary syphilis was decreased and the ratio of Th1/Th2 was also reduced. There was no difference in number of Th2 between the two groups (P＞0.05). It showed that there was a differentiation bias in Th1 cells in observation group. Conclusion The differentiation disorder of Th cells in peripheral blood and reduced ratio of Th1 cells might be a key factor that the body can not completely eliminate Treponema pallidum leading to latent infection in the body in long period.
Key words：Syphilis; Flow cytometry; Th1 differentiation bias; Treponema pallidum
梅毒是由苍白螺旋体梅毒亚种（T pallidum ssp pallidam, Tp）引起的慢性性传播疾病，机体对Tp抗原的免疫应答是清除Tp和造成组织细胞损害，出现临床症状和体征的根本因素。细胞免疫反应是梅毒感染期间发生皮肤病变的主要原因［1］ ,但是进入血液后的Tp是如何影响机体外周血CD4+T细胞亚群，目前尚不清楚。本实验拟用三色法流式细胞术检测二期梅毒患者外周血CD4+T细胞亚群细胞并与正常组对照，了解梅毒患者的细胞免疫功能状态，以探讨其在梅毒的发生、发展中的作用及意义。
1 材料与方法
1.1 病例选择
收集2001年11月～2002年11月到广东医学院附属医院皮肤科门诊的二期早发梅毒患者共30例，其中男13例，女17例，年龄18～48岁，平均（28.3±6.8）岁。所有病例均为初诊，未经驱梅及其它处理，血清RPR及TPPA试验均阳性，并排除其他性传播疾病，无自身免疫性疾病史，近4周内未进行免疫接种。对照组为20例健康体检者，其中男8例，女12例，年龄18～50岁，平均（28.6±7.2）岁。近4周内未进行免疫接种及排除自身免疫性疾病史，TRUST试验及TPPA试验皆为阴性。两组在性别、年龄等构成均无显著性差异。
1.2 主要实验材料
细胞激活剂为伊屋诺霉素（Ionmyctin）和佛波酯（PMA）；细胞因子出胞抑制剂为莫能菌素（Monensin）；T细胞表面抗体为CD4-cy5-R-PE；细胞因子抗体为IFN-γ-FITC（异硫氰酸荧光素），IL-4-PE（藻红蛋白）；同型对照抗体为IgG1-Cy5-R-PE，IgG1- PE，IgG1-FITC；细胞内染色试剂盒和红细胞裂解液购自Phar Mingen公司，RM PI 1640和胎牛血清购自Giblo Brl公司。
1.3 实验方法
静脉采血1ml肝素抗凝。用RMPI640培养基按1:1的体积稀释全血，充分混匀。向稀释血中加入刺激剂PMA，离子霉素和蛋白质转运抑制剂莫能霉素工作液（按试剂盒说明新鲜配制）各10μl。混匀后每200μl液体分别加入5ml塑料试管在37℃5%CO2环境中孵育4h。对细胞表面抗原进行染色，每管加入10μl，Cy-5-R-PE标记的CD4、CD8或对照单抗，常温孵育15min。加入2ml红细胞裂解液，暗环境中孵育10min，使红细胞充分裂解。1 000r/min离心5min，弃上清。2ml缓冲液（含热灭活胎牛血清及0.1%叠氢钠的DPBS缓冲液）洗1次，1 000r/min离心5min，弃上清。每管加4%多聚甲醛500μl，固定20min，1 000r/min离心5min，弃上清。然后每管加含0.1%皂素的破膜缓冲液破膜10min；1 000r/min，离心5min，弃上清。再用抗细胞因子单抗（10μl/管）室温避光染色30min,用2ml含0.1%皂素的破膜缓冲液洗涤1次，1 000r/min离心5min，弃上清。最后每管用500μl PBS2%多聚甲醛悬浮细胞。4℃冰箱保存，24h内上流式细胞仪检测。
应用流式细胞仪FACS cobular。根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，对FL1、FL2和FL3通道分别以相应的同种型IgG1染色细胞为阴性对照，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD4+细胞分泌的IL-4和IFN-γ情况进行检测。
1.4 统计学处理
用SPSS11.0 For windowns统计软件进行资料处理，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 用三标记方法检测患者CD4+阳性T细胞分泌细胞因子的类型。同时分泌IFN-γ和IL-4的CD4+细胞为Th0型, 只分泌IFN-γ+的CD4+为Thl，而只分泌IL-4+的CD4+细胞为Th2。与正常对照组相对，梅毒患者外周血中Th1细胞、Th1/ Th2受刺激后显著降低（均P>0.001），Th2、Th0无显著变化(P>0.05),见表1。表1 梅毒患者和正常对照组外周血Th细胞亚群比较（略）
2.2 梅毒患者外周血中致敏Th(Th1+Th2+Th0)细胞较正常对照组明显减少（P<0.001），见表2。表2 梅毒患者和正常对照组外周血致敏Th细胞亚群比较（略）
2.3 Th1比Th2细胞多，即分泌IFN-γ的CD4+细胞群要比分泌IL-4的CD4+细胞群多，(P<0.001),见表3。表3 梅毒患者及正常对照组外周血中Th1与Th2细胞的比较（略）
3 讨论
CD4+T淋巴细胞根据分泌细胞因子的不同可分为Thl、Th2、Th0细胞。Th1细胞主要介导细胞免疫应答，与DTH、CTL成熟、NK细胞激活等有关，参与抗肿瘤、抗病毒作用等；Th2细胞主要介导体液免疫应答，与移植物耐受、妊娠、自身免疫性疾病有关［2］。Th1细胞可分泌IFN-γ、IL-2等I型细胞因子，Th2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-10等Ⅱ型细胞因子。Th0细胞是Th的前体细胞，接受刺激后可转变为Th1、Th2细胞。本研究采用微量全血法检测Th细胞的极化状态是在尽可能模拟机体内环境的条件下，将肝素抗凝血经佛波酯(PMA）和离子霉素刺激后，应用莫能菌素阻断高尔基体释放细胞因子，然后利用抗CD4单抗标记出CD4+T细胞，再用抗IFN-γ、IL-4单抗标记细胞内IFN-γ、IL-4［4］。在CD4+T细胞中，仅表达IFN-γ或IL-4者是Thl或Th2细胞，同时表达IFN-γ和IL-4者是Th0细胞，此法能准确区分Th细胞亚群。
正常机体内，Thl/Th2网络维持着动态平衡。当Th1/Th2平衡失调时，即某一亚群功能增强，另—亚群功能减弱。CD4+T细胞在特异性抗原的刺激下可以向Th1或Th2方向分化，这两个极化在适应性免疫中起至关重要的作用。机体的抗TP免疫作用理论上应以Th1介导的细胞免疫为主，—旦Th1/Th2平衡向Th2方向漂移将造成免疫抑制状态，机体的抗TP免疫受到严重干扰。本研究结果证实了此理论，即二期梅毒患者Th1型细胞因子水平普遍降低。一方面，二期梅毒患者外周血中致敏Th淋巴细胞减少及Th1细胞减少，引起Th1型细胞因子分泌减少；这就削弱了Th1细胞因子介导的针对TP抗原的DTH，造成TP清除不彻底，从而导致梅毒病程的迁延。另一方面，Th1细胞亚群的减少导致Th2细胞亚群相对增多，增多的Th2细胞通过分泌高水平的Th2型细胞因子如IL-4和IL-10能够抑制Th0向Th1转化，同时辅助B细胞分泌高水平抗体，这与梅毒外周血中TP抗体滴度较高相符。
二期梅毒患者外周血中Th细胞的数量分布与皮损内的Th细胞分布数量几乎完全相反。皮损中浸润的淋巴细胞主要为表达Th1细胞因子即IL-1、IFN-γ和IL-12 的Th1细胞［4］，而本研究结果显示外周血中致敏CD4+细胞（即 Th1、Th2、Th0细胞的总和）、Th1细胞显著减少。这种皮损内与外周血中Th1细胞相分离的现象，可能是Th1细胞在趋化因子及其配体作用下选择性从血液中进入皮损，导致血液中Th1细胞显著减少；也可能是由TP抗原激活诱导的细胞死亡（activation-induced cell death, AICD）造成的［5］。目前的研究证实，Th1细胞易发生AICD，Th2细胞则对AICD的耐受性较强［6～7］。这可能是机体控制特异性免疫反应强度、避免免疫反答过强造成机体损害的一种重要的反馈调节机制，同时也可能形成一种外周淋巴细胞免疫耐受［8］。
另外，本研究还发现在CD4+ T细胞中，分泌IFN-γ的细胞群要比分泌IL-4的细胞群多，即Th1细胞比Th2细胞多（P<0.01）。这种高IFN-γ反应，是否说明机体对外来抗原的免疫反应首先表现为Th1反应，而Th2反应只是随后出现的负调节反应。与对照组相比，二期梅毒患者外周血中Th1细胞显著降低，而Th2、Th0细胞无显著变化。由于Th1细胞介导的DTH是机体清除TP最主要的免疫反应，因此Th1细胞减少而Th2细胞相对增多可能明显减弱针对TP抗原的持久性DTH，最终导致TP清除不全和梅毒的慢性感染。对梅毒患者Th细胞亚群分化状况的研究不仅可了解梅毒的免疫发病机制，而且能为更好地防治梅毒提供新的手段。
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作者单位：1.惠州市皮肤病医院,广东 惠州 516008; 2.广东医学院附属医院皮肤科,广东 湛江 524001.