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【摘要】 结核分枝杆菌耐药是引起结核菌感染和发病的主要原因之一。本文综述了结核分枝杆菌对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)、吡嗪酰胺(PZA)和氟喹诺酮类(FQ)等抗结核药物的耐药分子机制，同时也对耐药性检测方法，如：DS、PCR-RFLP、RCR-SSCP、Gene Chips、LiPA等进行综述。
【关键词】 结核分枝杆菌；耐药机制；检测方法
结核分枝杆菌(MTB)简称结核杆菌，于1882年由德国科学家Koch发现并证明是结核病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生状况的改善，结核病的发病率和病死率曾大幅度下降，但是80年代后艾滋病（AIDS）的流行使结核病猛然复活，如今世界上有1/3的人感染了结核分枝杆菌，每年有800万新患者出现，300万人死于结核病，同时结核分支杆菌耐药菌株不断的出现和传播造成结核分枝杆菌耐药率不断上升，给结核病的治疗和控制带来严峻的挑战。
在结核病治疗和控制的初期必须依赖于准确检测方法的实施，目前在临床实验室仍然采用常规方法，即绝对浓度法、比例法和抗性比率法，但这些方法均以细菌生长为终点判断结果，由于结核分枝杆菌生长缓慢，在得到分离培养物后仍需4～6wk方能获得结果，所以急需建立快速、准确、可靠的药物敏感性试验方法。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，结核分枝杆菌的耐药机制及耐药的分子基础大部分已被阐明，建立了快速检测结核分枝杆菌耐药基因的方法，为结核分枝杆菌快速药物敏感性试验开辟了一条新的途径。
1 结核分枝杆菌耐药分子机制
结核分枝杆菌抵制药物活性的机制，大致有三种类型:即降低细胞膜的通透性和外排泵机制，产生降解或灭活酶类，药物靶位的改变［1］。结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药性是MTB产生耐药的主要基础。目前对MTB耐药分子机制的研究主要集中在药物的作用靶位及其相关基因的突变上。
1.1 利福平的耐药基因
利福平是作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基β亚单位(RNA polymerase B subunit，rpoB)，从而抑制mRNA的转录。结核分枝杆菌对利福平耐药是结核病化疗失败的主要原因，并且利福平耐药性的检测是判断多重耐药结核病(MDR-TB)的标志。
rpoB基因是一单拷贝基因，序列高度保守，全长3 543个碱基。一些研究证实，当高度保守核心区域（RRDR）发生突变时利福平不能与RNA聚合酶β亚单位结合，抑制转录，约96％～98％的利福平耐药菌株编码RNA聚合酶β亚单位的rpoB基因突变导致细菌对利福平耐药［2～3］。主要的突变集中在编码27个氨基酸的81个碱基范围内［4］。其中，以531位Ser→Leu和Trp转换，526位His→Tyr、Asp、Asn和Pro的突变最为常见［5］，且以上两个位点的突变是引起高水平耐药的主要原因。除上述两位点外，511、516、518、522位点也有突变，相对531和526较少，且是引起低水平耐药的原因。除突变引起耐药外，细胞壁渗透性的改变导致药物摄入量的减少也是导致耐药的原因之一［6］。
1.2 异烟肼的耐药基因
结核分枝杆菌对抗结核化疗药物异烟肼的耐药机制较为复杂，约92％的INH耐药菌与katG，inhA和ahpC三个基因突变有关。其中katG和inhA基因是主要的耐药基因。katG的丢失或突变导致其编码的过氧化氢-过氧化物酶活性丧失或下降，而inhA基因突变减弱了异烟肼对分枝杆菌酸生物合成的抑制作用。此外，kasA和ahpC基因也与异烟肼的耐药也有一定的关系［7］。
1.2.1 katG基因
katG基因是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因。该基因含2223个核苷酸，上游隔44个碱基与furA基因相连，下游离cmbC基因2794碱基。katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶一种热稳定酶，相对分子质量为80000。引起异烟肼耐药性的主要原因是katG基因的点突变、部分缺失、碱基对插入或7%～24%的完全缺失［8］，其突变导致过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低或丧失，阻止异烟肼转换成活性形式，从而导致耐药。katG基因突变的位点为315位Ser→Thr、Asn、Ile或者Arg，463位Arg→Leu，还可见104Arg、108His、138Asn、148Leu、270His、275Thr、312Trp、381Asp密码子突变［9］。
1.2.2 inhA基因
inhA基因是一种与分枝菌酸生物合成有关的烯酰基还原酶的编码基因。异烟肼进入菌体后，在分枝杆菌过氧化氢—过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式，这种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶—还原型烟酰胺二核苷酸复合体结合，干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。inhA基因产物为相对分子质量为32000的蛋白质。研究发现,inhA基因的突变率较高的主要在280位Ser→Ala、94位Ser→Ala、90位Ile→Pro［1］。
1.2.3 ahpC基因
ahpC基因即烯酰基还原酶编码基因。它控制解毒酶基因的表达，如过氧化氢酶—过氧化物酶的编码基因KatG和烷基过氧化氢酶的编码基因ahpC的表达［10］。目前发现ahpC基因突变可导致ahpC表达增强，突变一般发生在启动子区域，使得启动子的活性提高,进而导致ahpc的过量表达。它的过量表达可以补偿因katG基因突变而造成的过氧化氢酶—过氧化物酶活的损失，为菌体提供额外的氧化保护。一般将ahpc基因突变作为katG基因损伤的标志［1］。
1.3 乙胺丁醇的耐药基因
乙胺丁醇是一种阿拉伯糖类似物，作用于分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸—阿拉伯半乳聚糖—蛋白聚糖复合物形成，发挥抗分枝杆菌作用。
最近的研究［11］表明结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因。embABC操纵子突变或emb蛋白表达增高有关，该操纵子由embC、embA和embB三个基因组成，其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是耐乙胺丁醇产生的主要分子机制。约47％～65%的耐EMB菌株与embB基因突变有关。结核分枝杆菌embB基因约3246bp，编码一个糖基转移酶embB基因突变使糖基转移酶结构改变，影响了乙胺丁醇和糖基转移酶的相互作用，从而导致耐乙胺丁醇的产生［12］。结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变主要发生在306位密码子，其为Met→Val、Ile、Leu置换。此外还有285位Phe→Leu，330位phe→Val和630位Thr→Ile置换［11］。
1.4 链霉素的耐药基因
链霉素是抗结核治疗中常用的氨基糖营类抗生类。Sm主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错误，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成［13］。
最近研究认为Sm耐药是由于其核糖体S12蛋白编码基因rpsL或16SrRNA编码基因rrs突变所致，80%耐SM结核分枝杆菌临床分离株可见rpsL或rrs突变［9］。rpsL基因最常见的是43位密码子Lys→Arg的突变，88位密码子也可发生同样突变。少数可见43位Lys→Thr的转变［14］。rrs基因突变主要集中于491位C→T，512位C→T，513位A→C或A→T，516位C→T，903位C→G或C→A，904位A→G的突变［15］。核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性，rpsL基因突变就会导致S12蛋白改变，从而严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰tRNA，更准确地表达mRNA的每一个密码，抑制了Sm诱导的遗传密码错误而产生耐药性。并且根据Morris［16］以及Heym［17］等的研究表明rpsL基因突变是Sm耐药的主要机理。
1.5 吡嗪酰胺的耐药基因
吡嗪酰胺是一种烟酰胺类似物，与异烟肼相似也是一种抗MTB的原药，但其发挥作用所要求的环境不同，吡嗪酰胺需要在酸性环境才表现抗菌活性且最低抑菌浓度(MIC)与pH值在7.0以下存在很好的正相关性。吡嗪酰胺通过被动扩散进入MTB细胞内，在MTB细胞内由吡嗪酰胺酶(PZase)将其转化为具有抗MTB活性形式的吡嗪酸，所以PZase活性对吡嗪酰胺表现抗MTB活性是必需的［18］。
众多的研究结果支持pncA基因的突变造成PZase活性降低或丧失是MTB产生对吡嗪酰胺耐药的主要原因。约72％～97％的吡嗪酰胺耐药菌株编码吡嗪酰胺酶的却pncA基因突变，pncA基因突变的显著特点就是突变位点繁多且分散，至今报道的已经证实的基因突变形式至少有175种［19］，突变位点分散在从基因上游调控序列到基因下游序列宽广的范围内，研究发现突变发生在3-17、6l-85和132-142位氨基酸残基的3个区域时PZase活性降低或丧失而使MTB表现对吡嗪酰胺耐药。
1.6 氟喹诺酮类的耐药基因
已用于临床抗分枝杆菌的氟喹诺酮类药物有氧氟沙星(Floxacin,OFL)，环丙沙星(Iprofloxacin,CIP)，司帕沙星(Parfloxacin,SPX)，莫西沙星(Oxifloxacin,MOX)，左氧氟沙星(Evofloxacin,LEV)，加替沙星(Atifloxacin,GAT)［20］。氟喹诺酮类药物的作用靶位是细菌的DNA旋转酶，阻抑DNA的复制，最终导致菌体死亡。Takiff［21］等研究表明MTB耐喹诺酮主要与DNA旋转酶的A亚单位和(或)B亚单位基因突变有关。DNA旋转酶由gyrA和gyrB两种基因编码的两个A亚单位和两个B亚单位组成。gyrA基因长2517bp，gyrB基因长2060bp。喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在gyrA基因保守区67-106位的密码子区。常见94位Asp→Asn或His或Ala，90位Ala→Val，88位Gly→Cys，83位Ala→Val的突变。gyrA基因突变与药物浓度和结构有关，且导致中、高度耐药，gyrB基因突变可能是改变胞内药物的积蓄而表现为低度耐药［10］。
1.7 结核分枝杆菌耐多药的分子机制
大多数的耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变累积所致，而且各种突变之间存在一定的关联，即染色体多个相互独立基因自发突变的逐步累加是MTB耐多药的分子基础。但目前还未发现由单一突变引起的耐多药菌株。Isik Somuncu J［22］等报道多耐药(MDR-TB)被定义为至少耐RMP和INH或者两者以上。但近期Ernesto J［23］报道结核分枝杆菌多耐药被定义为（XDR-TB），且耐药除RMP和INH外还有FQS，和Km、Am或者Cm。随着耐药株的不断增多和传播，给结核病的治疗带来前所未有的挑战，将来可能还出现(Total DR)，导致对所有药物产生耐药。
2 耐药基因检测方法
近年来，结核分枝杆菌(MTB)耐药性问题日趋严重，对其耐药基因的检测在结核病的治疗中有着举足轻重的作用。寻找一种简便、快速、准确的耐药性检测方法成为许多结核科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急切解决的问题。耐药基因检测的三步骤为：1，DNA样品的制备；2，PCR扩增已知与耐药性有关似的基因片段；3，扩增产物的耐药基因分析。现就其几中耐药性检测方法进行综述。
2.1 DNA测序(DNA sequencing)
DNA测序是用PCR的方法扩增待测耐药基因，对其产物纯化提取DNA片段之后进行测序，与其标准株的同一片段进行比较异同。目前DNA测序是检测基因突变的最可靠方法，不仅可用于突变的筛选，而且能确定突变碱基的部位和分布。因此是检测基因突变的判断突变的金标准，24～48h即可提供精确序列，对判断突变位点准确、及时，还可发现新的突变位点及应用于流行病学研究。但该法操作繁琐，费用昂贵，因此限制了它的临床推广应用，多用于评价其他检测方法的参考方法。
2.2 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）
PCR-SSCP其原理是PCR扩增产物经变性后可产生两条互补的单链，各单链的碱基序列不同而形成不同的空间构象，片段中单一碱基的置换既足以引起单链DNA空间构象的改变，这种改变又可导致该单链DNA电泳迁移率的相应变化，因而在凝胶上显现出不同的带形型。通过与标准参考株的带型比较，即可判断待检样品是否存在突变。
SSCP技术自1989年建立以来，因其操作简单，快速、不需特殊仪器设备和试剂、技术条件较为成熟、并且检出率相对较高，成为检测突变的技术之一。一些研究报道［24～25］用PCR-SSCP方法用于结核分支杆菌耐药基因的检测，均有较高的突变检测率。但SSCP操作技术要求较高，影响因素较多，如：DNA片段长度，胶浓度以及电泳温度等客观因素的影响，而且只能用于确定有无基因突变的分子而不能确定突变的部位和性质，所以限制其使用范围。
2.3 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）
PCR-RFLP其原理是用限制性内切酶作用于PCR扩增产物的特定酶切位点，获得特定片段，然后电泳，与对照株比较，观察带型有无异常。例如MTBrpsL基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被限制性内切酶MboII消化，产生两个较小的片段(电泳出现二条小分子bp带)，而有该位点突变的菌株不被消化，电泳仍可见大分子bp带［10］。本法通过测定待检菌株，并与药物敏感株带型比较，便可得知是否存在基因突变、及突变的部位，但不知突变的性质［26］。
2.4 基因芯片（gene chip）
基因芯片其原理是将多种探针固定在基片上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。由于该法同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对大量样品进行检测和分析。目前常用抗痨药物的耐药基因都已被发现，利用芯片技术可将针对所有这些突变的探针固定到一张芯片上，只须一次杂交，即可获得某一菌株对常用抗痨药物的药敏结果。崔振玲［5］等用基因芯片检测结核分枝杆菌耐利福平基因和异烟肼基因突变已取得一定的成果，结果表明方法准确、快速，特异性高，信息量大，成本较低，可准确地确定突变位点和突变类型，其具有潜在应用价值。
2.5 线性探针杂交法（line probe assay）
LIPA技术是一种刚开始在国外应用的体外线性DNA探针实验，国内这方面的研究甚少。它通过对阳性培养物的DNA扩增反应来检测分枝结核杆菌(MTB)复合物，并通过耐药基因位点突变的检测诊断耐药性结核。其原理是应用生物素修饰的特异引物扩增DNA，使PCR产物带有生物素标记物，将PCR产物变性后与固定在一张膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果。该方法简便，快速，5.5～24 h可获得结果。可信度高，但是受膜上探针的限制，不能检测出所有的突变类型。通过杂交信号而获得序列信息，与基因芯片技术有异曲同工之处，但LIPA技术相对基因芯片在制作过程中过仪器要求不高，比基因芯片的应用范围更加广泛。LIPA技术不仅可以用于病原微生物耐药基因的检测［20,22,27］而且还用于分型检测［28］。
另外，对结合分枝杆菌耐药性检测的方法还有异源双链构象法、分子灯塔法、RNA/RNA错配法、双脱氧指纹图谱法、实时荧光定量PCR等方法。
总上所述，随着分子生物学技术的不断进步，结核分枝杆菌耐药的分子机制和检测的方法有一定的进展，但我们必须清楚地认识到并不是每种药物只有一种耐药基因，甚至对个别基因与耐药的关系还未得到阐明，而且临床的检测手段在实际应用中有各方面的局限性，因此我们应该拓宽该领域的研究，寻找每种药物全部耐药基因，以及基因与耐药之间的关系，建立快速、简便、可靠的检测方法对其耐药性进行检测，以指导临床的早期治疗和有效的控制结核病。
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