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【摘要】 目的 建立离子交换高效液相色谱法测定帕米膦酸二钠的方法。 方法 采用IC-Paktm Anion HR色谱柱，以2mmol·L-1硝酸溶液（用5 mol·L-1硝酸溶液调节pH值至2.70）为流动相，检测波长230nm流速1.0mL·min-1，进样量30μl。 结果 帕米膦酸进样量在3.82～45.85μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9988,n=7)，回收率为100.0%(RSD=1.08%,n=9)。 结论 建立方法操作简便，结果准确,可应用日常实验的检测。
【关键词】 离子交换高效液相色谱 帕米膦酸二钠注射液 条件优化
Determination of content of pamidronate sodium by HPLC.
CAI Mei, XU Jin-xing.
(Hainan Provincial Institute for Drug Control, Haikou 570216, Hainan, P. R. China)
Abstract：Objective To establish an ion-exchange HPLC method for the determination of content of pamidronate disodium for injection. Methods The determination was performed on IC-Paktm Anion HR(150mm×4.6mm) column with 2mmol·L-1 nitric acid (adjust pH=2.70 with 5mol·L-1 nitric acid) as mobile phase at a flow rate of 1.0ml·min-1，the sample size was 30μl and the detection wavelength was 230nm. Results The linear range of pamidronate was 3.82～45.85μg(r=0.9988,n=7). the mean recovery rate was 100.0%(RSD=1.08%,n=9). Conclusion The methed is convenient,accurate and suitable for the assay of pamidronate disodium injection.
Key words：Ion-exchange HPLC；Pamidronate disodium injection；Assay
帕米膦酸二钠（Pamidronate Disodium）为3-氨基-1-羟基丙叉-1、1-二膦酸二钠五水合物，是唯一一个在临床上广泛应用的具有氨基的双膦酸类药物，是第二代双膦酸盐类药物。帕米膦酸二钠可强烈抑制羟磷灰石的溶解和破骨细胞的活性，对骨质的吸收具有十分显著的抑制作用。对癌症的溶骨性骨转移所致的疼痛有止痛作用，亦可用于治疗癌症所致的高钙血症。与第一代双膦酸盐药物如依替膦酸钠相比，具有疗效好，毒副作用小，选择性高，安全性好的特点［1～3］。帕米膦酸二钠注射液目前已收载于国家药品标准［4］，利用的是本品结构中含有伯胺，可与荧光胺衍生反应后产生荧光，经色谱柱分离后采用荧光检测器检测的RP-HPLC法［5］。英国药典则是采用示差检测器测定高效液相色谱［6］。本试验采用以阴离子交换树脂为填充剂、紫外检测器间接测定的高效液相色谱法测定帕米磷酸的含量，方法简便，专属性好，检验快速，结果可靠。
1 材料与方法
1.1 仪器与试药 Agilent 1100高效液相色谱仪（四元泵G1311A，二极管阵列检测器G1315B、自动进样器、柱温箱及Agilent化学工作站）。IC-Paktm Anion HR (4.6mm×150mm，Waters，Made in Japan) 色谱柱。帕米膦酸对照品及帕米膦酸二钠注射液（规格10ml∶30mg，批号为A240313，A240314；规格10 ml∶60 mg，批号为B240311，B240312）均由海南某制药厂提供。亚磷酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、硝酸均为分析纯，水为纯化水。
1.2 测试液的制备
1.2.1 对照品溶液 精密称取帕米膦酸对照品约75mg，置100ml量瓶中，加0.01mol/L氢氧化钠溶解并稀释至刻度。
1.2.2 供试品溶液 取本品15ml，置50ml（规格：10ml：30mg）或100ml（规格：10ml：60mg）量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
1.3 色谱条件 IC-Paktm Anion HR (4.6mm×150mm，Waters)色谱柱，流动相采用2mmol·L-1硝酸溶液（用5mol·L-1硝酸溶液调节pH值至2.70）；流速1.0ml·min-1；检测波长230nm；柱温为35℃；进样量30μl。
2 结果
2.1 系统适应性 精密称取帕米膦酸对照品、磷酸二氢钾对照品及亚磷酸对照品适量，加0.03%氢氧化钠溶液制成每1ml中含帕米膦酸0.9mg、磷酸二氢钾0.2mg及亚磷酸0.2mg的混和溶液作为分离度试验溶液。量取30μl进样，记录色谱图，见图1。帕米膦酸峰与磷酸盐峰及亚磷酸盐峰的分离度符合规定。
图1 分离度试验图谱（略）
1-帕米膦酸；2-磷酸盐；3-亚磷酸盐
Fig 1 HPLC chromatograms of resolution
1-pamidronic acid； 2-phosphite； 3-phosphate
2.2 最低检测限 取0.764μg·ml-1的帕米膦酸氢氧化钠溶液，进样60μl，量取峰高，峰信号约为噪音的3倍，即最低检测限为0.045μg。
2.3 线性关系 精密称取帕米膦酸对照品（无水物）38.2mg，置50ml量瓶中，加0.01mol·L-1氢氧化钠溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液5、10、20、30、40、50、60μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以X为进样量（μg），Y为峰面积,进行线性回归，回归方程为Y=2.023×102X-99.07(r=0.9988,n=7) 。结果表明帕米膦酸（无水物）在进样量为3.82～45.85μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系，可满足测定要求。
2.4 精密度试验 量取对照品溶液30μl，照上述条件，连续进样6次，记录色谱图，结果RSD为0.75%。
2.5 重复性试验 取供试品溶液6份（规格：10ml：30mg，批号A240313），量取30μl，照上述条件进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量，结果RSD为1.19%，表明本方法的重复性良好。
2.6 稳定性试验 取重复性试验项下的供试品溶液1，分别于0、2、4、6、8、10h，照上述条件进样分析，记录色谱图，以峰面积为指标考察方法中样品的稳定性。结果RSD(n=6)为0.45，表明供试品溶液在10h内稳定。
2.7 回收率试验 取已知含量（98.3%）的帕米膦酸二钠注射液（10ml：30mg）15ml，分别置9个100ml量瓶中，每3个瓶中分别加入已知浓度（约3.8mg·ml-1）的帕米膦酸对照品6.00ml、10.00ml、14.00ml，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按含量测定方法操作，结果见表1。
表1 加样回收率（略）
Tab 1 Recovery of phenol analytes
2.8 样品测定 分别取对照品溶液及供试品溶液30μl注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按外标法以峰面积计算，并乘以校正系数1.187。结果见表2。
表2 样品含量测定结果（略）
Tab 2 Results of samples determination
3 讨论
3.1 溶剂的选择 帕米膦酸在水中溶解，在乙醇中不溶，在氢氧化钠试液中易溶。经试验，称取帕米膦酸对照品63.8mg,加水20ml,超声20min，部分溶解；称取帕米膦酸对照品62.6mg,加0.1mol·L-1氢氧化钠20ml,溶解；称取帕米膦酸对照品63.5mg,加0.01mol·L-1氢氧化钠20ml, 超声20min，部分溶解。故最终选择0.03mol·L-1氢氧化钠作为溶剂。
3.2 专属性研究 分别测定流动相、水、0.03mol·L-1氢氧化钠、含帕米膦酸、磷酸二氢钾及亚磷酸的溶液，结果表明对帕米膦酸二钠的测定无干扰。
3.3 校正系数 无水帕米膦酸的分子量为235.07，无水帕米膦酸二钠的分子量为279.03，故校正系数为1.187。
帕米膦酸二钠本身无可检测的生色基团，无法直接应用紫外或荧光检测器测定［7］。本试验以阴离子交换树脂为填充剂、以硝酸溶液作为流动相，利用帕米膦酸二钠注射液中各种阴离子与离子交换剂的亲和力不同而被分离，采用紫外检测器间接测定的高效液相色谱法测定帕米磷酸的含量，并适用于帕米磷酸二钠的有关物质检查，可测定其降解产物如磷酸盐、亚磷酸，方法简便，专属性好，检验快速，结果可靠。
【参考文献】
［1］ FANG Yue(方阅)，GUI Cheng(归成).Progress of pharmacological studies and clinical application of pamidronate(帕米膦酸钠的药理研究及临床应用进展)［J］.J China Pharm(中国药房)，2002，13（12）：757.
［2］ 钟永祥，张祥斌.帕米膦酸二钠的临床应用进展［J］.中华全科医师杂志，2005，4：27.
［3］ Flcisch H.Bisphosphonates:pharmacology and use in the treatment of tumour–induced hypercalcacmic and metastatic bone discase［J］.Drugs,1991,42:919.
［4］ 国家药典委员会. 国家药品标准新药转正标准［M］.第58册.北京：人民卫生出版社，2006,47.
［5］ 孔俐文，胡志远，王东凯，等.反相高效液相色谱测定帕米膦酸二钠的含量［J］. 中国药房， 2007，18（1）：60.
［6］ BP2000(英国药典2000年版)［M］，2000,576.
［7］ 谢赞，蒋晔.双磷酸类药物反相液相色谱分离与应用研究［J］.河北医科大学，2006.
作者单位：海南省药品检验所，海南 海口 570216.