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【摘要】 目的:探讨噬菌体生物扩增法(Phab)快速检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:应用Phab、罗氏法及涂片法共同检测236例痰标本。结果:痰标本3种方法检测结果比较：236份临床确诊的活动性肺结核患者痰标本，涂片、罗氏培养和Phab法检查结果分别有64 份(27.1％)、78 份(33.1％ )和114份(48.3％)阳性；比较Phab与涂片和培养的阳性检测率，Phab检出率远高于涂片法，差异有统计学意义(χ2= 77.706，P<0.01)， Phab检出率高于罗氏法检出率，差异有统计学意义(χ2=95.678，P<0.01)。结论:FASTPlaque TB方法能快速、简便地检测结核分枝杆菌，且检出率较高，可作为结核病诊断的重要方法。
【关键词】 分枝杆菌噬菌体；分枝杆菌；结核；快速检测
结核病是一种较严重的传染病，目前的疫情呈上升趋势。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，痰中结核杆菌的检测方法常规采用痰涂片及痰培养。涂片虽简单易行，但阳性率低，培养虽为金标准，但周期太长，均难以满足临床需要。因此，快速、灵敏的细菌学检查方法研究历来是国内外学者所关注的课题。噬菌体生物扩增方法(Phab)是近年来建立的一种细菌学快速诊断新技术，具有简便、快速、灵敏、价廉的优点，非常适合结核分枝杆菌(结核菌)这类生长缓慢细菌的快速诊断［1］ 。
1 材料和方法
1.1 标本来源 236份临床确诊的肺结核患者痰标本取自我院结核科住院患者。
1.2 试剂 FASTPlaque TBTM结核分枝杆菌快速诊断试剂盒(Phab)由英国Biotec公司生产，上海金浩科技发展有限公司提供。
1.3 方法 ①Phab法：噬菌体生物扩增法按照试剂盒操作说明书操作，培养皿(平皿)中出现大小不等的菌斑，且≥20个／平皿，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量≤19个／平皿为阴性。②涂片和培养检查：按照中国防痨协会制订的结核病细菌学检验规程进行分枝杆菌的涂片和培养检查。按试剂盒要求进行操作。
1.4 统计学方法 采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
痰标本3种方法检测结果比较：236份临床确诊的活动性肺结核患者痰标本，涂片、罗氏培养和Phab法检查结果分别有64 份(27.1％ )、78 份(33.1％ )和114份(48.3％)阳性（见表1），差异有统计学意义(χ2=24.426，P<0.01）；比较Phab与涂片和培养的阳性检测率，Phab检出率远高于涂片法(见表2)，差异有统计学意义(χ2= 77.706,P<0.01)， Phab检出率高于罗氏法检出率(见表3)，差异有统计学意义(χ2=95.678,P<0.01)。
表1 三种检测方法检出率的比较（略）
表2 Phab法与涂片法检测结果比较（略）
表3 Phab法与罗氏法检测结果比较（略）
3 讨论
结核病的细菌学检查不仅是发现传染源的主要途径和手段，也是结核病确诊和制订抗结核方案、考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。但由于结核分枝杆菌的遗传特性决定其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂、所需时间较长和影响因素较多、不易标准化等缺陷，使结核分枝杆菌细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。因此，发展特异性强、敏感度高、快速、简便、经济的结核病细菌学检查方法是大家共同期盼的。
FASTPlaque TBTM是第一个利用噬菌体生物扩增技术并使之商品化的试剂盒，噬菌体D29作为指示物直接检测标本中的结核分枝杆菌。基本原理是以噬菌体感染活的分枝杆菌并大量增殖将细菌裂解，释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞，并将其裂解，在平皿上出现噬菌斑，根据噬菌斑的数量判定阳性结果，如待测标本不含结核分枝杆菌，则噬菌体被随后加入的杀病毒剂杀灭，平皿中无噬菌斑，为阴性。由于噬菌体及敏感细胞均能快速增殖，本法从标本采集处理到结果判定只需18～24小时。其特异度、敏感度高且快速，使之在检测结核分枝杆菌中得以快速推广。
近20年来，噬菌体生物扩增法已广泛应用于分枝杆菌的快速检测［2，3］，并已取得良好效果。Albert等［3］检测1618份可疑肺结核患者痰标本，敏感度为87％，特异度为83％，阳性率为94％；本研究中236份临床确诊的活动性肺结核患者痰标本，涂片、罗氏培养和Phab法检查结果分别有64 份(27.1％ )、78 份(33.1％ )和114份(48.3％)阳性；比较Phab与涂片和培养的阳性检测率，Phab检出率远高于涂片法和罗氏培养法(P<0.01)。
本研究结果表明，噬菌体裂解法作为检测结核分枝杆菌的方法，具有常规检测所不具备的优势，主要表现为：①敏感性较高：该实验能检测到200～300集落形成单位(cfu)／ml菌悬液，资料显示其敏感性高达95%［4］。而McNerney 等［5］证实能检测到100cfu／ml，其敏感性是涂片镜检的100倍。②特异性高：噬菌体D29只对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌呈阳性，而对非结核分枝杆菌和非分枝杆菌呈阴性反应［4］。③该方法省时，方便：噬菌体裂解试验从标本的收集处理到结果的读取只需18～24小时，大大缩短了检测时间，并且可以直接确定标本中有无活的结核分枝杆菌，对及早诊断、及时治疗具有重要的参考价值。④噬菌体裂解法无需昂贵的自动化仪器，操作技术难度低，只需标准的微生物学操作，便于在临床实验室推广应用。尽管如此，噬菌体裂解法也有如下不足，表现为：①只能检测活的结核分枝杆菌，不能检测死的结核分枝杆菌，因此，也就不能检测放置久的标本。②由于分枝杆菌可以根据噬菌体进行分型，分枝杆菌表面的受体结构存在微细的变化即可导致噬菌体不能感染分枝杆菌。目前，这一技术涉及的噬菌体主要集中在DS-6A、D29和TM4。
【参考文献】
［1］ McNemey R．TB：The return ofthe phage、A review offifty years ofmycobacteriophage research［J］．Int J Tuberc Lung Dis，1999．(3)：179-l84．
［2］ 靳安佳，王 沽，胡忠义，等．噬菌体生物扩增法检测肺结核患者痰标本临床应用研究［J］．中华检验医学杂志，2005，28：807-808．
［3］ Albert H ，Heydenrych A，Breokes R ，et a1．Performance of a rapidphage——based test，FASTPIaqueTB，to diagnose pulmonary tuberculosisfrom sputum specimens in South Africa［J］．Int J Tubere Lung Dis，2002，(6)：529-537．
［4］ 胡忠义，庞茂银，靳安佳，等．应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分枝杆菌［J］．中华结核和呼吸杂志，2001，24(10)：611-613．
［5］ McNerney R，Kambashi BS，Kinkese J，et a1．Development of a bacteriophage phage replication assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2004，42(5)：2115-2120．
作者单位：新乡医学院第一附属医院结核内科,河南 卫辉 453100;新乡医学院第一附属医院结核病研究所