点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨虎杖与黄芪组方抗人疱疹病毒（HSV）时，其有效成分白藜芦醇与总黄酮之间的相互作用对药效的影响。 方法 以阿昔洛韦（ACV）为阳性对照，采用空斑减数实验，用中效作用原理对虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮合用抗Ⅱ型人疱疹病毒HSV-2333株的药效进行了分析。 结果 在Hep-2细胞系统中，ACV对HSV-2333株增殖抑制的ED50为10.85μg/ml。当虎杖白藜芦醇与总黄酮以1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的比例合用时，对HSV-2333株直接杀灭、感染阻断、增殖抑制的ED50依次为0.91μg/ml，1.12μg/ml，0.77μg/ml;合用指数（Combination Index，TI）均<1.0，P<0.0005，说明这一合用比药效最强，协同作用最明显。 结论 ACV对HSV-2333株增殖抑制的治疗指数（Treatment Indices，TIS）为100。1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮对HSV-2333株直接杀灭、感染阻断、增殖抑制的TIs为125.5，102.0，148.3，为最佳合用比。
关键词 虎杖白藜芦醇 黄芪总黄酮 Ⅱ型人疱疹病毒333株
The effect analysis of antiherpes simplex virus type-2strain333with combination of resveratol of Rhizoma polygoni cuspidati and total flavonoids of Astragalus membranaceus
Wang Zhijie，Huang Qishan
Virus Research Institute，Medical College of Wuhan University，Wuhan430071.
【Abstract】 Objective In order to exploit the influence which was produced by the interaction between the ef-fective components resveratol and total flavonoids on efficiency of antiHSV-2strain333，when an antiHSV medicinal Chinese herbs preparations was made up using Rhizoma polygoni cuspidati and Astragalus membranaceus，we carried out this research.Methods ACV was used as positive control，through plaque reduction assays，analyzed the combi-nation effects between resveratol and total flavonoids on HSV-2strain333usingMedian Effect Principle.Results In Hep-2cell systems，the median effect dose（ED50）of ACV of reproduction inhibition to HSV-2strain333was10.85μg/ml.When resveratol was combined with total flavonoids at1（Dm）resveratol/1（Dm）total flavonoids，the ED50s of direct virucidal activity，the infection blockage and reproduction inhibition to HSV-2strain333were0.91μg/ml，1.12μg/ml，0.77μg/ml respectively;the combination indices were all<1.0，and the relevant coefficients of Median Effect Equations of this ratio were all0.99，P<0.0005.It indicated that the effects of this ratio was the strongest，the synergism of which was the most obvious.Conclusion The TIs of ACV of reproduction inhibiton to HSV-2strain333was100.The TIs of1（Dm）resveratol/1（Dm）total flavonoids of direct virucidal activity，the infection blockage and reproduction inhibition to HSV-2strain333were125.5，102.0，148.3separately.This ratio should be of first choice.
Key words resveratol of Rhizoma polygoni cuspidati total flavonoids of Astragalus membranaceus HSV-2strain333
Ⅱ型人疱疹病毒（HSV-2）可引起生殖道疱疹、子宫内膜炎等疾病，又是宫颈癌的协同诱因。HSV还可引起脑炎、脑膜炎 ［1］ ，有HSV-2原发感染的孕妇有可能发生母婴传播 ［2］ ，引起新生儿脑炎、全身播散性感染等，从而导致 ［3］ 偏瘫、智力发育迟缓（P<0.05）;经颅多普勒检查异常（P=0.034）及脑干听觉诱导异常（P=0.023）。在HSV感染早期，HSV就在感觉神经节建立了潜伏感染。临床上首选药物为阿昔洛韦（ACV）。在艾滋病患者或骨髓移植的受者，HSV的去氧胸腺嘧啶激酶基因容易发生突变，对ACV产生抗性。国外进行临床实验的HSV-2糖蛋白D和B重组疫苗对人类反复发作的生殖道疱疹没有作用 ［4］ ，HSV-1亚单位疫苗 ［5］（Skinner疫苗）虽可使女患者生殖道疱疹复发率降低，但是结果没有统计学意义。HSV又因为有γ34.5蛋白 ［6］ 和ICP0蛋白 ［7］ ，对IFN-α、IFN-β有抗性。研究开发抗HSV的新药，始终都是医药工作者的重要任务，因此我们进行了抗HSV复方中药的研究。虎杖白藜芦醇（晶Ⅱ）是虎杖抗HSV-1株和HSV-2333株的有效成分之一 ［8，9］ ，黄芪总黄酮是黄芪抗HSV-2的主要有效成分 ［10，11］ 。我们曾用中效作用原理对虎杖与黄芪合用抗HSV-1 ［12］ 、HSV-2 ［13］ 的药效进行了比较分析，为了探讨虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮之间的相互作用对组方时药效的影响，我们进行了此项研究。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药 虎杖、黄芪由武汉大学医学院中南医院中药房提供，经中南医院中医科方学韫、鲁遂荣教授鉴定为虎杖（Rhizoma polygoni cuspidati）和膜夹黄芪〔Astragalus mem-branaceus（Fisch）Bunge A〕。虎杖用水提醇沉法处理，水液用苯萃取后，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解，反复精制，得深棕色粉末状物质。这种抽提物易溶于水，Borntrager反应和Molish反应阳性，经过对这种抽提物进行溴化钾压片红外光谱的观察，证明此化合物具有蒽醌结构。同时对此化合物进行的质谱、高压液相色谱—质谱联用（LC/MS）、气相色谱—质谱联用（GC/MS）分析，所得结果与曾里 ［14］ 和陈雷 ［15］ 等的结果一致，证实此化合物是白藜芦醇（3，4，5-三羟基二苯乙烯）。黄芪总黄酮的提取基本上按照侯云德等的方法 ［16］，即将黄芪水煎液经水提醇沉法处理后，水溶液过聚酰胺柱，留柱物用乙醇洗至基本无色，洗脱物减压浓缩，室温放置干燥得黄芪总黄酮提取物。此提取液在可见光下无色，在UV光下呈紫色。将其喷在滤纸上干燥后，暴露于氨蒸气中，可见光下无色，UV光下紫色。如果喷刷碳酸钠，显灰绿色。黄芪总黄酮提取物与三氯化铝反应，可见光下无色，UV光下显黄绿色荧光;与浓硫酸反应，显黄色;与镁粉及浓盐酸反应显黄色。这两种提取物在-20℃放置3年之久，理化性质稳定，用空斑减数实验证实，其生物学活性不变。用含10%二甲基亚砜（DMSO）的PBS配制浓度依次为10000μg/ml，430.3μg/ml的虎杖白藜芦醇、黄芪总黄酮母液，G6漏斗过滤，分装，待用。
1.1.2 ACV 批号为980751-3（丽珠集团湖北科益药业有限公司）。
1.1.3 细胞和病毒 Hep-2细胞是人喉癌细胞株，购自武汉大学细胞保藏中心。HSV-2333株由本所保存。按本所常规培养细胞，繁殖病毒，HSV-2333株TCID50为10 -9 /0.1ml。
1.2 方法
1.2.1 空斑减数实验 本实验采用的实验方法基本上与文献 ［13］ 相同。所有抗HSV-2实验均以ACV为阳性对照，设置正常细胞对照以及单用病毒感染实验时加入等体积含10%DMSO的PBS的阴性对照。实验以三种方式进行:（1）药物对HSV-2的直接杀灭作用:病毒悬液与含药培养液37℃孵育1h，感染细胞。（2）药物对HSV-2感染细胞的阻断作用:以含药培养液预先与细胞在37℃孵育2h，再以HSV-2感染细胞。（3）药物对HSV-2增殖的抑制作用:先以HSV-2感染细胞，再以含药培养液孵育。每步操作后均以培养液将细胞洗3次。所用感染复数均为每个细胞1个空斑形成单位（Plaque forming unit，Pfu）。经过上述处理的细胞加入细胞维持液（含0.5%羧甲基纤维素），观察48h，用10%甲醛固定，0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率（%）=（病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数）/（病毒对照组空斑数）×100%。
1.2.2 药物合用的实验设计 按韩锐主编的《肿瘤化学预防及药物治疗》一书中的方法进行 ［17］ 。即以三种药物合用比例，2（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮;1（Dm）白藜芦醇/1 （Dm）总黄酮;1（Dm）白藜芦醇/2（Dm）总黄酮进行HSV-2的空斑减数实验，每种比例采用以上所述的三种实验方式进行。
1.2.3 细胞毒性实验 长成单层的Hep-2细胞，以含10（Dm）～100（Dm）浓度的白藜芦醇、总黄酮加入细胞生长液，加到Hep-2细胞上37℃孵育72h，以台盼蓝拒染法计数死活细胞数。
1.3 统计学方法
1.3.1 药效的ED50和细胞毒IC50的计算 采用加权直线回归法。
1.3.2 合用结果评判 根据Chou和Talalay导出的多种药物效量公式:fa/fu=（D/Dm） m 及合用指数方法 ［18］ 。上式中fa和fu各代表系统中反应及未反应部分，D是剂量，Dm代表产生中效作用的剂量（ED50）。如果上式的两边采用对数，则可用统计学是直线回归的方法作出中效作用图，可以计算出产生不同空斑减数率（fa）所需的药物浓度，求合用指数（Combination Index，CI）。对于相互不排斥的药物，CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2。对于相互排斥的药物，CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2+（D）1（D）2/（Dx）1（Dx）2。其中（Dx）1、（Dx）2分别是第1种和第2种药物单用时产生某一fa数值时的剂量，（D）1、（D）2则是这两种药物合用时产生相同fa数值时其中所含第1种及第2种药物的剂量。CI<1.0，表示协同;CI=1.0，表示相加;CI>1.0，表示拮抗。
2 结果
2.1 虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮合用对HSV-2333株的直接杀灭作用 见表1、表2、表3。从表1可见，白藜芦醇与黄芪总黄酮合用的ED50及ED90比两种药物单用时小，说明合用比单用药效好。其中以1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的ED50及ED90最小，药效最好。从表2可见，三种合用比的合用指数（CI）均<1.0，证实白藜芦醇与总黄酮合用有明显的协同的直接杀灭作用，仍以1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮CI最小，协同作用最明显。从表3可见，三种合用比中效方程的相关系数均为0.99，P<0.0005，说明这些结果差异具有非常显著性。
2.2 虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮合用时对HSV-2333株的感染阻断作用 见表1、表2、表3。从表1可见，白藜芦醇与黄芪总黄酮合用的ED50及ED90比两种药物单用时小，这些结果提示合用比单用药效好。从表2可见，三种合用比的合用指数（CI）均<1.0，证实白藜芦醇与总黄酮合用对HSV-2333株有显著协同的感染阻断作用。重要的是，1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的ED50及ED90最小，CI最小，药效最好，协同作用最明显。从表3可见，三种合用比中效方程的相关系数均为0.99，P<0.0005，差异具有非常显著性。
2.3 虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮合用时对HSV-2333株增殖的抑制作用 见表1、表2、表3。从表1可见，白藜芦醇与总黄酮合用时的ED50及ED90比ACV及两种药物单用时的ED50及ED90小，因此合用比单用药效好。从表2可见，三种合用比的CI均<1.0，提示两种药物合用时对HSV-2333株的增殖具有显著协同的抑制作用。仍以1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的ED50、ED90、CI最小，药效最好，协同作用最明显。从表3可见，三种合用比中效方程的相关系数均为0.99，P<0.0005，差异具有显著性。
表1 白藜芦醇与总黄酮合用抗HSV-2333株的ED20～ED90数值（略）
表1列出了在直接杀灭、感染阻断、增殖抑制三种实验中，白藜芦醇、总黄酮单用及以三种不同比例合用时产生20%、40%、50%、60%、80%、90%空斑减数率的用药量，称为ED20、ED40、ED50、ED60、ED80、ED90，单位为μg/ml。
表2 白藜芦醇与总黄酮合用产生20%～90%空斑减数率时的合用指数（略）
表2列出了白藜芦醇与总黄酮以三种比例合用时，产生20%、40%、50%、60%、80%、90%空斑减数率时的合用指数（CI）。上排是假定白藜芦醇与总黄酮相互不排斥的CI值;下排是假定白藜芦醇与总黄酮相互排斥时的CI值。
表3 白藜芦醇与总黄酮合用抗HSV-2333株的中效方程参数（略）
注: △ P<0.0005
2.4 虎杖白藜芦醇与黄芪总黄酮合用的细胞毒作用 ACV对Hep-2细胞的细胞毒IC50为1085μg/ml。白藜芦醇的IC50为336.8μg/ml。总黄酮的IC50为161.4μg/ml。2（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的IC50为174.6μg/ml;1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的IC50为114.2μg/ml;1（Dm）白藜芦醇/2（Dm）总黄酮的IC50为137.8μg/ml。
3 讨论
从表1、表2、表3的结果可以得出以下结论:（1）白藜芦醇与总黄酮合用比单用抗HSV-2333株药效好;（2）白藜芦醇与总黄酮合用对HSV-2333株有协同的直接杀灭、感染阻断、增殖抑制作用。以1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的药效最好，协同作用最明显;（3）这些结果具有统计学意义。
治疗指数（Treatment Indices，TIs）=ED50/IC50。ACV对HSV-2333株增殖抑制的TI为100。如果按直接杀灭、感染阻断、增殖抑制的顺序排列，白藜芦醇的TIs为137.5，109.3，86.8;总黄酮的TIs为33，59，46;2（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的TIs为94.4，98.6，65.9;1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮的TIs为125.5，102.0，148.3;1（Dm）白藜芦醇/2（Dm）总黄酮的TIs为74.9，48.7，115.8。与ACV、白藜芦醇、总黄酮的TIs比较，1（Dm）白藜芦醇/1（Dm）总黄酮是最好的合用比。
参考文献
1 Chu K，Kang DW，Lee JJ，et al.A typical brainstem encephalitis caused by herpes simplex virus.Arches Virology，2002，59（3）:460-463.
2 Rudick CM，Hoe KZ mea S.Neonatal herpes simplex virus infection. American Family Physician，2002，65（1）:1138-1142.
3 钱继红，敖黎明.先天性无症状Ⅱ型单纯疱疹病毒患儿近期预后观察.临床儿科杂志，2001，19（3）:137-139.
4 Strans SE，Kost RG，Mckenzier，et al.Immunotherapy of recurrent geni-tal herpes recombinantherpes simplex virus type-2glycoproteins D and B:results of placebo-controlled vaccine trial.J Infect Dis，1997，176（5）:1129-1134.
5 Skinner GR，Turgk ME，Benson CA，et al.The efficacy and safety of skinner herpes simplex vaccine towards modulation of herpes genitalis:report of a propective double-blind place bo-controlled trial.Meal Microbiol Immunol，1997，186（1）:31-36.
6 Chang G，Brett ME，He B.Val193and phe195of the gammal34.5pro-tein of herpes simplex virus-1are requied for viral resistance to inter-feron alpha/beta.Virology，2001，290（1）:115-120.
7 Harle P，Sain ZB，Carr DJ，et al.The immediate-early protein ICP0is essential for the resistance of herpes simplex virus to interferon alpha/beta.Virology，2002，293（2）:295-304.
8 王志洁，方学蕴，程仲敏.虎杖乙酸乙酯萃取部分抗人疱疹病毒研究.中国现代应用药学，1999，16（5）:27-31.
9 王志洁，黄铁牛.虎杖多种蒽醌化合物对豚鼠皮肤Ⅰ型人疱疹病毒感染的治疗作用.中国现代应用药学，2004，21（2）:103-106.
10 王志洁，黄铁牛，刘焱文.黄芪多种成分抗人疱疹病毒的初步实验研究.中国现代应用药学，2002，21（2）:34-36.
11 王志洁，黄铁牛.黄芪多种成分对豚鼠皮肤Ⅰ型人疱疹病毒感染的治疗作用.中国现代应用药学，2003，20（6）:452-455.
12 王志洁，程仲敏，方学韫.虎杖黄芪合用抗Ⅰ型疱疹病毒药效分析.中国中药杂志，1999，24（3）:176-180.
13 王志洁，黄铁牛.虎杖黄芪合用抗HSV-2药效分析.安徽中医学院学报，2000，19（3）:37.
14 曾里，连春霞，夏之宁.超声提取虎杖白藜芦醇及其液质联用分析.重庆大学学报，2002，25（7）:53-56.
15 陈雷，杨福全，张天佑，等.虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇甙的高速逆流色谱分离提纯及其分析.分析测试学报，2000，19（4）:60-62.
16 侯云德，宋代军，傅丰永.黄芪某些生物活性的有效部分的研究.中西医结合杂志，1984，49（7）:420.
17 韩锐.肿瘤化学预防及药物治疗，第2版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994，315-351.
18 Ting Chao Chou，Paul TaLaLay.Generalized equations for the analysis of inhibitions of michaelis-memon and higher order systems with two or more mutually exclusive and non-exclusive inhibitions.Eur J Biochem，1981，115:207.
（编辑商志伟）
* 基金项目:湖北自然科学基金资助项目（编号:980J78）
作者单位:430071湖北武汉武汉大学医学院病毒研究所
264002山东烟台万华集团