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【摘要】 目的 了解血管内皮生长因子（VEGF）在IgA肾病患者肾组织中的变化及其与IgA肾病临床与病理表现之间的关系。 方法 采用特异性抗体与免疫组织化学染色方法，对26例IgA肾病患者肾组织中VEGF的分布与强度变化进行了观察，并结合临床及肾脏病理进行分析。 结果 IgA肾病VEGF主要在肾小球的脏层上皮细胞表达，轻度和中度病理改变者VEGF表达明显增强，而重度病理改变者VEGF表达明显减弱。在轻、中度病变，肾小球内VEGF表达与患者24h尿蛋白定量呈正相关（r=0.583，P<0.05）;在重度病变中无相关性。肾小球内VEGF表达与患者血压、血肌酐水平无明显相关性。 结论 在轻、中度病变中肾小球内VEGF表达增强，且与24h尿蛋白定量呈正相关，与血压、血肌酐水平无明显相关性，提示VEGF在IgA肾病患者肾组织内表达异常增加，促进蛋白尿形成。VEGF介导了IgA肾病患者肾小球内皮细胞损伤和功能紊乱的发生。
关键词 内皮生长因子 IgA肾病 病理类型
Expression of vascular endothelial growth factor in the vary pathology of lgA nephropathy
Jin Lin，Shen Hanchao，Li Hua
Shanghai Harbour Hospital，Shanghai200031.
【Abstract】 Objective To evaluate distribution and expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）in the kidneys of IgA nephropathy（IgAN）and their relationship with clinical and pathological manifestations.Methods 26patients with renal biopsy-proven IgAN enrolled this study，whose renal tissue were subjected to immunohisto-chemical staining by4-layer method using monoclonal anti-VEGF antibodies.The relationship of expression pattern of VEGF and clinicopathological manifestation was also investigated.Results It was found that there were a strong differences in both of the distribution and staining intensity of VEGF in the kidney of patients with IgAN.There was increased expression of VEGF in the glomerules，that glomerular immunologic peroxidase anti-Peroxidase staining of VEGF in patients with IgAN（mesangial proliferative IgAN）.There was decreased expression of VEGF in the glomerules，that glomerular immunologic peroxidase anti-Peroxidase staining of VEGF in patients with IgAN（sclero-sis of IgAN）.The expression of VEGF in the glomerules of mesangial proliferative IgANwas upregulated correlated to proteinuria（83.3%vs37.5%，P<0.01）.No relationship of VEGF upregulation with hypertension was found.Con-clusion Upregulated glomerular VEGF expression closely associated with marked proteinuria.VEGF may participate in the glomerular endothelial impairment.
Key words endothelial growth factor IgA nephropathy pathological type
肾脏疾病的发生、发展与机体微血管的病变有关。IgA肾病存在着肾小球内皮细胞功能异常;肾小球内皮细胞是肾小球血管壁的重要组成成分，对于维护肾小球血管壁的完整性具有重要的意义。血管内皮生长因子（VEGF）是一种促进血管内皮生长及渗透的分子，能促进内皮细胞的增生、迁移，增强内皮细胞的通透性，参与了微血管病变的病理过程;而其增加血管通透性的作用是组胺的5万倍;在肾脏组织中，VEGF浓度和分布的变化与肾脏疾病患者蛋白尿的产生密切相关，同时组织中的VEGF含量与病变的程度相关。Bailey ［1］ 和Shulman［2］ 等均发现，微小病变患者肾组织中VEGF在mRNA及蛋白水平明显高于正常对照;刘志红 ［3］ 等研究显示糖尿病肾病患者肾小球VEGF无论是分布还是其强度变化上与正常人相比差异均有显著性;患者肾组织中VEGF及VEGF-R的表达增加与糖尿病肾病（DN）患者蛋白尿形成、糖尿病视网膜病变以及内皮细胞损伤所致的形态学改变密切相关。VEGF的表达减少与肾脏纤维化也有一定关联，对肾脏病的发生、发展、预后均起重要作用;近年研究表明VEGF在IgA肾病患者肾组织内表达异常增加，在不同病理病变程度表达强度不同，可能与IgA肾病的发病机制及病变程度相关;为了阐明VEGF在IgA肾病中的作用，本研究采用免疫组织化学染色的方法，通过观察IgA肾病患者肾组织中VEGF的表达，分析VEGF表达与IgA肾病患者的临床表现及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 26例IgA肾病患者，男15例，女11例，年龄21～56岁，平均（29.8±10.5）岁;26例患者均行肾活检术，临床表现及肾组织病理检查均符合IgA肾病诊断。根据病理改变程度分为轻度（10例）、中度（8例）、重度（8例）;轻度:肾小球绝大多数正常或局灶系膜增殖和硬化（<50%），无小管—间质病变。中度:系膜弥漫增殖和增宽，局灶间质水肿，无小管萎缩。重度:系膜弥漫增生和硬化，部分或全部小球硬化，可见新月体，小管萎缩。详细收集这些患者肾活检时的24h尿蛋白定量、血压、肾功能等资料，分为少量蛋白尿（<2.0g/24h）组和大量蛋白尿（≥2.0g/24h）组;正常血压组和高血压组;血肌酐正常组和血肌酐升高组。
1.2 观察指标
1.2.1 肾组织病理学检查 肾穿刺活检组织经甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为2μm，分别行HE、PAS、PASM和mas-son三色染色，观察病理形态学、免疫荧光学改变。
1.2.2 免疫组化染色 对IgA肾病患者肾活检组织进行VEGF染色，具体步骤:组织蜡片按2μm切片，常规脱蜡，1%H 2 O 2 —甲醇阻断内源性过氧化物酶10min，置抗原修复液中（枸橼酸，枸橼酸钠，pH6.0）600W微波修复抗原10min，PBS漂洗，10%BSA室温封闭。加入第一抗体小鼠抗人VEGF单抗（试剂由Maxim Biotech，Inc公司提供）孵育，次日用PBS漂洗后加入辣根过氧化物酶孵育;PBS漂洗，DAB-H 2 O 2 显色，封片观察。VEGF在肾组织中的表达强度依据辣根过氧化物酶着色深浅分为+～+++。
1.3 统计学方法 计数资料采用χ 2 检验;以P<0.05代表差异有显著性，P<0.01代表差异有非常显著性。
2 结果
2.1 VEGF在正常肾组织中的分布 正常肾组织中VEGF主要分布在部分肾小球脏层上皮细胞和近端肾小管上皮细胞。
2.2 VEGF在IgA肾病患者肾组织中的分布 IgA肾病患者肾组织VEGF的免疫组化染色和正常人相比存在以下变化:（1）在分布上:VEGF除了在肾小球的脏层上皮细胞、近端小管上皮细胞阳性外，壁层上皮细胞及系膜区也有表达，但强度不等;（2）在表达强度上:26例IgA肾病患者中有12例表达明显增加，而轻度和中度病理改变者以VEGF为主，6例患者肾小球VEGF表达与正常人相比无明显变化;而重度病理改变者尤其以肾小球硬化病变VEGF表达明显减弱（8例），如图1、图2。
A:肾小球内VEGF表达增强
B:肾小球内VEGF表达正常
图1 IgA肾病患者肾小球组织VEGF表达PAP染色结果（系膜增生性IgA肾病）（PAP，×400）（略）
图2 IgA肾病患者肾小球组织VEGF表达PAP染色结果（IgA肾病肾小球硬化）（PAP，×400）
2.3 肾小球VEGF表达与蛋白尿、血压、血肌酐的关系 见表1～3。发现VEGF表达增强（以轻、中度组为主），中、大量蛋白尿的发生率明显高于VEGF表达正常及减弱组（P<0.01）;VEGF表达减弱组（重度病变组）中血肌酐升高的发生率高于VEGF表达增强及正常组（轻、中度组）;而高血压发生率差异无显著性（P>0.05）。
表1 肾小球VEGF表达与蛋白尿、血压、血肌酐的关系（略）
注:与VEGF表达正常相比， ▲ P<0.01
表2 血肌酐与蛋白尿两组VEGF表达比较（略）
注:与VEGF表达正常相比，χ 2 =8.77， ▲ P<0.01
表3 高血压与蛋白尿两组VEGF表达比较（略）
注:与VEGF表达正常相比，χ 2 =0.63， ▲ P>0.05
3 讨论
IgA肾病存在着肾小球内皮细胞功能异常;VEGF是一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，具有促进内皮细胞增殖、促进血管生成、增加血管通透性以及血管维持功能，是新生血管形成的主要调控者。VEGF是基因编码的糖蛋白，分子量为34～45kD，由两个相同的分子量为23kD的亚基通过二硫键结合成二聚体，基因定位在染色体的6p21.3，全长28kb，由8个外显子和7个内含子 ［5］ 构成。VEGF的生物学作用:（1）促进血管通透性;（2）VEGF能强烈促进血管内皮细胞有丝分裂使血管生成;（3）VEGF可刺激人的内皮细胞产生NO，并使其浓度呈剂量依赖性增加，起到血管维持作用 ［6］ ;（4）促进内皮细胞的增殖，加快血管内皮愈合。研究发现 ［7］VEGF在肾脏中的相对量是VEGF（165）>VEGF（120）>VEGF（188），neuropilin-1的表达，VEGF（165）与flk-1的连接，促进和维持着肾小球的发育。
正常情况下，胎儿与成人肾组织VEGF主要在肾小球脏层上皮细胞（足细胞）表达，并以VEGF（165）为主，集合管上皮细胞VEGFmRNA有弱表达，肾小球内皮细胞与活化的系膜细胞可合成VEGF，VEGF在正常肾组织中表达可能是通过自分泌或旁分泌的方式来调节内皮细胞的生理功能 ［8］ 。肾小球足突细胞分泌VEGF，在肾小球内皮细胞表面存在VEGF受体的表达，VEGF能够减少肾小球基底膜阴离子数目，诱导肾小球内皮细胞的小窗形成 ［9］ ，故VEGF可能通过同时影响肾小球基底膜的电荷屏障及机械屏障而调节肾小球通透性，VEGF分泌的异常增加可以导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加，从而导致蛋白尿的形成。据报道，近端肾小管在缺氧时，通过缺氧诱导因子-1（HIF-1）引起VEGFmRNA显著表达，而VEGF促使肾微血管的通透性增加和单核细胞的渗出。近期发现 ［10］ 肾小管缺氧损害时，VEGFmRNA及蛋白的合成并不增加，小管细胞中预先合成的VEGF重新分布到细胞侧面，说明肾脏可能具有独特的VEGF调节机制以应激急性缺氧，Kanellis等人 ［11］ 应用多种抗体免疫组化染色法发现VEGF两种抗体（flk-1/KDR）在正常鼠体内肾小管中表达，推测VEGF可诱导肾小管上皮细胞的增生及抗凋亡反应，说明VEGF能维持体内肾小管上皮细胞的存活。
本研究结果显示，在轻、中度病理病变中，尤其以系膜增生性病变为主，肾小球内VEGF表达增强，且大量尿蛋白发生率明显增高，提示VEGF在IgA肾病患者肾组织内表达异常增加，促进蛋白尿形成。肾小球足细胞持续表达VEGF，足细胞分泌的VEGF有可能穿过肾小球基底膜，与内皮细胞上的VEGF受体结合而发挥其促血管通透性增强的作用，从而调节肾小球滤过膜的通透性。VEGF的上述特点，提示其在蛋白尿的产生中可能起重要作用。事实上，在此以前，血管通透因子（VPF）在蛋白尿形成中的作用已为人们所共识;后来的研究证实VEGF与VPF实际为同一物质。许多研究表明，VEGF与蛋白尿的关系密切。把大剂量的VEGF注射到大鼠体内可诱发蛋白尿发生［12］ ;并且在BSA诱导的大量蛋白尿大鼠的肾组织中，系膜区、肾小球脏层、壁层上皮细胞VEGFmRNA的表达明显高于对照组 ［13］ 。本研究的发现也证实这一点。
Choi等报道慢性肾间质疾病时，肾小管分泌的VEGF增加，肾小球分泌的VEGF减少，易发生间质纤维化 ［14］ 。这种VEGF的改变使得周围血管丧失、肾间质缺血而致肾间质疾病，最终导致肾功能减退。陈香梅等发现在重度病变时，肾小球内VEGF的表达与24h尿蛋白定量无相关性，可能是随着IgA肾病病理改变程度的加重，肾小球脏层上皮细胞损伤导致屏障破坏的结果 ［15］ 。Kang DH等发现，在有残余肾功能的鼠模型，VEGF表达和血管新生明显减少，提示VEGF表达可能减少肾组织纤维化和稳定肾功能 ［16］ ;本研究发现在重度病变时，肾小球内VEGF表达反而减少，可能与重度病变时肾小球系膜硬化加重导致脏层上皮细胞损伤，故而VEGF产生减少有关。
本文通过对IgA肾病患者肾组织VEGF的研究表明，IgA肾病患者肾组织中VEGF的表达无论在分布还是在表达强度上与正常人相比差异均有显著性。IgA肾病患者肾小球VEGF表达增强与IgA肾病患者蛋白尿水平关系密切，表明VEGF介导了IgA肾病患者肾小球内皮细胞损伤和功能紊乱的发生;而在重度病变时VEGF表达减少，提示随着IgA肾病进展，病理改变程度的加重，肾组织分泌VEGF减少，使肾功能进一步恶化。
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（编辑新 竹）
作者单位:200031上海港医院
310009浙江大学附属第二医院
310016浙江大学附属邵逸夫医院