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【摘要】 目的 观察补清冲剂和拉米夫定联合应用治疗慢性乙型肝炎的疗效及对慢性乙型肝炎病毒P基因酪氨酸—蛋氨酸—天门冬氨酸（YMDD）区域的影响。 方法 收集慢性乙型肝炎病毒（HBV）DNA阳性慢性乙型肝炎患者64例，分为拉米夫定组、拉米夫定加补清冲剂组，分别检测血清HBV-DNA、肝脏生化指标和P基因YMDD区域变异。 结果 在治疗52周时，拉米夫定加补清冲剂组无论是HBV-DNA阳性率（9.1%），还是YMDD变异率（6.1%）都比拉米夫定组低。 结论 初步研究证明，拉米夫定加补清冲剂合用能在一定程度上提高治疗慢性乙型肝炎的疗效，并可能减少YMDD的变异。
关键词 补清冲剂 拉米夫定 慢性乙型肝炎 基因变异
在慢性乙型肝炎（CHB）临床中，长期用于治疗HBV感染的核苷类似物拉米夫定可引起HBV的P基因变异 ［1］ ，相对集中于YMDD区域，突变的YI（异亮氨酸）DD或YV（缬氨酸）DD，而且变异后产生耐药性，使疗效下降。中药治疗CHB也有一定的疗效。本课题观察本院制剂补清冲剂和拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效，同时检测治疗无效的CHB患者HBV基因（HBVP）的YMDD区域，来观察联合用药对YMDD区域的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料 HBV-DNA阳性的CHB患者64例均为北京中医药大学附属东直门医院2000年8月～2003年12月的门诊或住院患者，男34例，女30例;年龄16～48岁，平均37.6岁;病程1～12年，平均5.2年。所有病例随机分为两组，拉米夫定组31例，男16例，女15例，年龄17～43岁，平均（28.1±5.02）岁，病程（5.13±0.65）年;拉米夫定加补清冲剂组33例，男18例，女15例，年龄15～46岁，平均（32.3±3.09）岁，病程（5.67±0.42）年。两组病程、性别、年龄等一般情况，经统计学处理差异无显著性，具有可比性。
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准 按2000年（西安）中华医学会传染病与寄生虫病分会联合修订的《病毒性肝炎的诊断标准》中关于HBV-DNA阳性的慢性乙型肝炎的标准 ［2］ 。
1.2.2 中医辨证标准 肝肾亏虚兼湿热证（GB中医证候诊断标准）的慢性乙型肝炎患者。主症:（1）头晕眼花;（2）腰酸软;（3）口苦;（4）胁肋胀痛。次症:（1）两胁隐痛;（2）耳鸣;（3）失眠多梦;（4）两目干涩;（5）脘腹痞胀;（6）纳呆呕恶;（7）厌食油腻;（8）尿黄;（9）舌质红;（10）脉弦滑或弦数。凡具备主症三项，即属本证;具备主症（2）、（3）或（1）、（4），即属本证;具备主症（3）、（4）中任一项及次症（1）、（2）、（3）、（9）及（10）中任两项，亦属本证;具备主症（1）、（2）中任一项及次症（5）～（10）中任两项，属本证。
1.3 治疗方法 对照组:拉米夫定（英国葛兰素药业公司产品）100mg，每天1次口服，疗程为52周。治疗组:拉米夫定100mg，每天1次口服，52周为一疗程，同时冲服补清冲剂（由巴戟天、何首乌、枸杞、叶下珠、虎杖、丹参、青皮等组成，由东直门医院中药制剂室制备成补清冲剂，每包10g）20g，每天2次，疗程为52周。
1.4 观察指标
1.4.1 血清HBV-DNA检测 采用PCR荧光定量检测，试剂购自上海复星实业有限公司。仪器采用FX-990荧光检测仪。
1.4.2 肝脏血清生化指标的检测 丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）采用酶动力法。
1.4.3 血清HBVP YMDD区域变异检测 方法参考文献 ［3］ 。分别选择两组治疗52周时血清HBV-DNA测定为阳性的14例患者血清进行检测。试剂购自第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心550型酶标仪及基因扩增仪。
1.5 统计学方法 采用SPSS软件统计。计数资料用χ 2 检验，计量资料采用t检验。HBV-DNA PCR结果进行对数转换。
2 结果
2.1 YMDD变异类型 所有患者治疗前血清检测均未见YMDD变异。治疗52周时，两组HBV-DNA阳性患者YMDD变异检测结果见表1。两组HBV-DNA阴转率比较，治疗组90.9%（30/33），与对照组为64.5%（20/31）比较差异有显著性（P<0.05）。治疗组YMDD变异率6.1%与对照组（25.8%）比较差异有显著性（P<0.05）。
表1 两组HBV-DNA阳性患者YMDD变异检测结果（略）
注:与对照组比较， * P<0.05
2.2 治疗后YMDD基因变异 与HBV-DNA水平比较见表2，两组治疗前后HBV-DNA水平差异无显著性（P>0.05）。10例YMDD变异者中，6例血清HBV-DNA水平低于其治疗前水平，4例无YMDD变异者中，2例血清HBV-DNA水平低于其治疗前水平，提示HBVP YMDD变异可导致疾病复发或对药物不完全应答，是病毒耐药的重要原因。
2.3 两组治疗前后ALT含量比较 见表3。治疗后两组HBV-DNA阳性者的ALT均明显高于HBV-DNA阴性者;两组HBV-DNA阴性者的ALT显著低于治疗前。
表2 两组治疗前后HBV-DNA阳性者的HBV-DNA水平比较 （略）
表3 两组治疗前后ALT含量比较 （略）
注:与HBV-DNA（-）治疗后比较， * P<0.01;与HBV-DNA（-）治疗前比较， △ P<0.01
3 讨论
3.1 拉米夫定与YMDD变异 拉米夫定治疗HBV感染时，作用于HBV的DNAP。DNAP的催化中心存在高度保守的特殊功能性序列即YMDD基序，YMDD是DNAP结合底物dNTP合成DNA所必需的最重要的序列，也是拉米夫定抗病毒治疗时常出现变异的区域。
P基因可分为5个区（A～E），拉米夫定耐药株的P基因变异多位于B区和C区，其中以C区YMDD变异最常见。YIDD和YVDD这两种变异虽然使病毒复制水平有所下降，但是对药物产生耐受力，仍然持续复制并致病。拉米夫定治疗HBV时，第52周变异发生率大约为13%～32% ［4］ 。本课题拉米夫定组YMDD变异发生率25.8%（8/31）。拉米夫定耐药株出现后1～2周内，HBV-DNA水平明显升高，但多数患者HBV-DNA水平仍低于治疗前水平。本课题拉米夫定组，治疗后HBV-DNA水平略低于治疗前，差异无显著性（P>0.05）。这是因为，虽然YMDD变异株较无变异株对拉米夫定敏感性下降，但病毒本身的复制能力也明显下降。随后2～4周出现转氨酶和胆红素的升高，即肝功能损害表现。本课题对照组治疗后HBV- DNA阳性者ALT值与治疗前比较差异无显著性。
然而，据报道 ［5］ ，在保持ALT正常达1年以上的无症状HBV携带者18例，有5例检测到YMDD变异。该5例均为抗-HBe阳性，且年龄有相对增高的趋势。自然存在于未经拉米夫定治疗的无症状携带者中的YMDD变异病毒的复制能力较低，且可能不增加肝炎的活动程度。有学者认为，YMDD变异株容易出现在携带大量HBV的患者中［6］ 。因此，年龄相对较老的患者体内存在自年轻以来的大量病毒，可能会由于宿主长期的免疫压力而导致变异株的产生。
3.2 补清冲剂治疗CHB 中医对CHB临床表现的症状、体征都有详细描述，分别归属于“胁痛”、“黄疸”、“积聚”等范畴。临床上，CHB的中医辨证一般认为其发生与湿热疫毒有关，病机复杂。由于湿热疫毒蕴蒸肝胆而致疏泄失司，脾胃阻遏而运化失常，病势缠绵，久病及肾，因此确立滋补肝肾、清热化湿的治疗方法。
3.3 拉米夫定与补清冲剂合用治疗CHB 拉米夫定治疗CHB有较好的疗效。但耐药株出现时，停药一段时间后病毒又可恢复到以野生株占优势，如果再次应用相同药物治疗，其效果不明显，目前尚未有理想的药物能预防或治疗拉米夫定YMDD变异株的产生。本课题以拉米夫定与补清冲剂合用治疗CHB，结果显示，治疗组HBV-DNA阴转率高于对照组，治疗组YMDD变异发生率低于拉米夫定组。初步表明，拉米夫定与补清冲剂合用能在一定程度上提高治疗CHB的疗效，并可能减少YMDD变异，这有可能为临床上提高治疗CHB疗效及推迟、预防拉米夫定耐药株的发生提供一种有效的方法。两类药合用时，补清冲剂可能增强拉米夫定与DNAP上位点的结合能力，从而抑制病毒的复制;同时补清冲剂可能有稳定P基因YMDD的作用，从而减少变异的发生。总之，挖掘中药在CHB治疗方面的潜力对于提高中西医结合防治CHB水平具有现实的意义和临床应用价值。
参考文献
1 孙剑.慢性乙型肝炎核苷类似物治疗过程中耐药性的产生及防治.国外医学·内科学分册，1998，25（10）:422-425.
2 中华医学会传染病与寄生虫病分会，肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8（6）:324-329.
3 王虹.采用PCR微板核酸杂交-ELISA技术进行HBV-DNA基因分型的研究.中华微生物学和免疫学杂志，2001，21（2）:234-236.
4 Dusheiko G.Lamivudime therapy for hepafitis B infection.Scand Gas-troenterol，1999，230（suppl）:76-81.
5 Kobayashi，Ide T，Sata M.Detection of YMDD motif mutations in some Lamivudine-untreated asymptomatic hepatitis B Vivus carriers.J Hep-atot，2001，34（4）:584-586.
6 Atkine M，Hunt CM，Brown N，et al.Clinical significence of YMDD mutant hepatitis B virns（HBV）in alavge cohort of Lamivudine-tveated hepatitis B patients.Hepatology，1998，28:329A.
（编辑田 雨）
作者单位:514011广东省梅州市梅州中医院内科
100700北京中医药大学附属东直门医院