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【摘要】 目的 研究中老年脑梗死患者apoB基因多态性及不同基因型的血脂水平区别。方法 采用病例对照的方法检测中青年与老年脑梗死患者apoB基因的EcoRI和XbaI等位基因频率，并对不同基因型的血脂水平进行测定。结果 中青年脑梗死组E-等位基因频率（0.36），明显高于老年组（0.20）（P<0.05）；而X+等位基因频率中青年组（0.07）与老年组（0.04）比较差异无显著性，P>0.05；中青年组具有E-等位基因型者的apoB水平明显高于具有E+等位基因型者，具有X+等位基因型者的TG、apoB水平明显高于具有X-等位基因型者、HDL-C水平则明显低于具有X-等位基因型者，均P<0.05；中青年组具有X+等位基因型者的TG、apoB水平明显高于老年组。结论 E-、X+等位基因型是引起中青年人发生脑梗死的重要危险基因型，而且是通过造成脂代谢紊乱而起作用的。
【关键词】 脑梗死；基因多态性；载脂蛋白B；中老年人
The comparing study of cerebral infarction and apolipoprotein B polymorphism among middle-aged person and the aged in Tianjin
WANG Jing-hua,NING Xian-jia,TU Jun.
Department of Neuroepidemiology,Tianjin Neurology Institute,Tianjin Medical University Hospital,Tianjin 300052,China
【Abstract】 Objective To study the apoB gene polymorphisms and the lipoprotein level character of different gene expression of cerebrovascular infarction among middle-aged person and the aged.Methods The EcoRI,XbaI gene relative frequency,the serum lipoprotein levels in patients with cerebrovascular infarction among middle-aged group and the aged were measured by case-control study.Results The relative frequency of E- gene expression among middle-aged group (0.36) was outstanding higher than that among the aged (0.20),P<0.05.But the relative frequency of X+ gene expression among two groups weren’t difference,P>0.05. The serum apoB level with the E- gene expression among middle-aged group was outstanding higher than that with E+ gene expression,and the serum TG,apo-B, level with the X+ gene expression was outstanding higher,the HDL-C was lower than that with X- gene expression.But the serum TG,apoB,apoB level with X+ gene expression in middle-aged group were significant higher than that in the aged group.Conclusion E-,X+ gene expression were the leading risk gene expression causing cerebrovascular infarction in middle-aged person.It could be caused by resulting the disorder of lipid metabolism.
【Key words】 cerebral infarction;gene polymorphism;apolipoprotein B;middle-aged and aged person
脑血管病是影响当今人类生命健康的重要原因之一，通过多年来各国学者对脑血管病的流行病学特征及有关的危险因素进行了深入细致的研究，并取得了很大进展。近年来，随着分子分物学研究的广泛深入，对与脑血管病发病有关的遗传标志，特别是载脂蛋白B基因多态性的研究也日益广泛。本文研究了中老年脑梗死患者apoB基因多态性特点，为进一步研究脑血管病发病特点，特别是预防低龄化人群发生脑梗死，提供可靠的依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 病例选自2000年9月～2001年8月期间，在天津医科大学总医院神经内科住院的脑梗死病人。要求经CT或MRI确诊，符合脑梗死的诊断标准。对照组为在我院外科及理疗科就诊或住院病人中以及在我院查体人员中选取的与病人同性别、同年龄组（±1岁）、无神经系统疾病的正常人。
1.2 研究内容与方法 填写统一的调查表，内容包括以下方面。
1.2.1 一般资料 性别、年龄、文化水平、民族、在津居住年限。
1.2.2 实验室检查 甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白A及B（apoA、apoB）。
1.3 apoB基因多态性检测
1.3.1 基因组DNA的提取 取空腹静脉血1ml，加入2%EDTA混匀抗凝、离心，加3倍体积蒸馏水溶解红细胞，得到白细胞和红细胞膜的混合物；在白细胞混合物中加入TES、SDS、蛋白酶K裂解、消化细胞膜，加入等体积的TES饱和酚、氯仿抽提出DNA；在95%的乙醇溶液中用玻璃棒缠绕DNA，并溶解于TES缓冲液中备用。
1.3.2 基因组DNA的扩增 在离心管中依次加入缓冲液、4种脱氧三磷酸核苷酸混合物（dNTP）、上下游引物混合物（每种引物50pmol）、基因组DNA、TaqDNA聚合酶，高压超纯水补充总反应体积至50μl，混匀，以少量石蜡油覆盖。扩增温控条件：95℃预变性5min后，92℃变性30s，58℃退火和延伸共5min，30个循环后，58℃保温10min结束。琼脂糖凝胶电泳，90V，1h，检查PCR扩增产物。引物序列为：15′—GGA GAC TAT TCA GAA GCT AA，23′—GAA GAC CCT GAA GAC TGA CT。
1.4 PCR扩增产物的分析
1.4.1 XbaI酶切位点 在20μl含XbaI酶切片段（710bp）的PCR扩增液中，加入限制性内切酶，37℃消化4h。2%琼脂糖凝胶电泳，70V 2h，有酶切位点的产生两条分别为433bp和277bp片段的为X+等位基因，无酶切位点时仅产生一条710bp片段的为X-等位基因。
1.4.2 EcoRI酶切位点 在含EcoRI酶切片段（480bp）的PCR扩增液中加入限制性内切酶EcoRI，37℃消化4h；2%琼脂糖凝胶电泳，70V 2h，有酶切位点的产生两条分别为253bp和227bp片段的E+等位基因，无酶切位点时仅产生一条480bp片段的为E-等位基因。
1.5 统计学方法 所有资料均输入计算机，用SPSS软件进行分析。其中酶切结果与脑卒中的关系部分应用χ2检验的方法进行分析；不同酶切结果的血脂水平之间的差异用t检验的方法进行分析。
2 结果
2.1 一般情况 本研究共收集病例227例，按年龄分为两组，55岁以下（包括55岁）为中青年组，55岁以上为老年组；其中中青年组122例，男78例、女44例，老年组105例，男63例、女42例；经统计，两组性别差异无显著性（P>0.05）。
2.2 两组基因频率比较 结果见表1。
表1 脑梗死组与对照组基因相对频率比较 略
表1结果表明：中青年组和老年组E-等位基因相对频率分别为0.36和0.20，有明显的统计学差异，X+等位基因的相对频率分别为0.07和0.04，无明显的统计学差异（P>0.05）。
2.3 两组不同基因类型的血脂水平分析
2.3.1 EcoRI酶切位点 两组不同EcoRI基因型的血脂水平比较见表2。结果表明中青年组具有E-基因型者的apoB水平明显高于具有E+基因型者，P=0.004；而老年组不同EcoRI基因型的血脂水平差异无显著性（P>0.05）。
表2 两组E+和E-血脂水平 （略）
2.3.2 XbaI酶切位点 两组不同XbaI基因型的血脂水平比较见表3。结果显示：中青年组具有X+基因型者的TG、apoB水平明显高于具有X-基因型者，P均为0.000，HDL-C却明显低于X-基因型者，P为0.001；而老年组仅显示具有X+基因型者的TG水平明显低于具有X-基因型者，P为0.046。
表3 两组X+和X-血脂水平 （略）
2.4 相同基因型不同年龄组血脂水平
2.4.1 EcoRI酶切位点 表4结果表明：E+、E-基因型血脂水平两组无明显统计学差异（均P>0.05）。
2.4.2 XbaI酶切位点 由表5结果可见，具有X+基因型者的TG、apoB水平明显中青年组明显高于老年组，P分别为0.000和0.016；而具有X-基因型者两组的血脂水平无明显统计学差异（均P>0.05）。
表4 两组不同EcoRI基因型血脂水平 （略）
表5 两组不同XbaI基因型血脂水平 （略）
3 讨论
apoB是一种糖蛋白，肝源性的apoB-100在人的肝脏中合成，为极低密度脂蛋白合成和分泌所必需，且作为由LDL受体介导的从血液循环中清除vLDL、IDL、LDL过程的配体。因此apoB-100对于血浆中的胆固醇和甘油三酯的转运和代谢、维持体内恒定的血脂水平起重要的作用［1］。
目前，关于EcoRI酶切位点对脑血管病的影响报道较少，对中老年人的对比研究也未见报道；而对apoB的XbaI多态性研究较多，多数认为XbaI多态性与血脂水平及AS关系密切。有研究表明，北京汉族人群冠心病组E-等位基因相对频率高于对照组，但未达到统计学差异（P>0.05）［2］；XbaI酶切位点的X+等位基因与脂质代谢紊乱有关，体外动力学研究也进一步支持临床发现：具有X+基因型的LDL与其受体的结合力及经受体介导的清除率均低于具X-基因型的LDL［3］。
关于脑梗死病人X+等位基因相对频率的研究国内已见报道。郭阳等学者的研究结果表明，病人组X+等位基因的相对频率显著高于对照组（P<0.005）［4］。
本文的研究结果表明，中青年脑梗死组E-等位基因频率（0.36），明显高于老年组（0.20）（P<0.05），而X+等位基因频率中青年组（0.07）与老年组（0.04）差异无显著性（P>0.05）。
许多研究已经证实脑梗死患者的HDL低于正常人群［5，6］，本文的研究结果表明，中青年组具有E-等位基因的apoB水平明显高于具有E+等位基因型者，具有X+等位基因型者的TG、apoB水平明显高于、HDL-C水平则明显低于具有X-等位基因型者（均P<0.05）；中青年组具有X+等位基因型者的TG、apoB水平明显高于老年组。
笔者认为：E-、X+基因型是通过造成脂代谢紊乱导致中青年人提前发生脑梗死，能否说明遗传因素对引发中青年人脑梗死的影响要大于老年人，有待于进一步研究探明。
【参考文献】
1 Olofsson SO,Bjursell G,Bostrom K,et al.Apolipoprotein B structure biosynthesis and role in the lipoprotein assembly process.Atherosclerosis,1987,68:1.
2 叶平，王士雯，陈宝生.载脂蛋白B基因多态性与冠心病关系的研究.中华医学遗传学杂志，1995，12（2）：75.
3 Heath F，Hansen PS,Gerdes LU,et al.Binding defective low density lipoprotein identified in subjects with specific polymorphisms of the apolipoprotein B gene.Atherosclerosis,1995,115:68.
4 郭阳.缺血性脑血管病患者载脂蛋白B基因多态性与血脂关系探讨.中风与神经疾病杂志，1996，13（6）：339.
5 Renges HH,Wile DB,Mckeigue PM,et al.ApoB gene polymorphisms are associated with lipid levels in men of South Asia descent. Atherosclerosis,1991,91:267.
6 Mendis S,Shepherd J,Packard CJ,et al.Restrective fragment length polymorphisms in apo-B gene relation to coronary heart disease in a Southern Asian population.Clin Chim Acta,1991,196:107.
作者单位： 300052 天津，天津市神经病学研究所 天津医科大学总医院
（编辑：田 雨）